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Biology

簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用

Published: January 25, 2018
doi:
10.3791/57258
,
1Department of Biology,California State University, Northridge

Summary

我々 は生きているセルで複雑な規制とシグナル伝達メカニズムを研究するダイズプロトプ ラストの大量の準備のためシンプルで効率的なプロトコルを開発しました。

Abstract

大豆 (最高グリシン(l.)ダイズ) は重要な作物を遺伝学的、生化学的経路の研究マメ科のモデルとなっています。そのため、大豆の効率的な一過的遺伝子発現系を確立することが重要です。ダイズプロトプ ラストの準備のための単純なプロトコルと非定常の機能解析への応用を報告します。ダイズ芽ばえから若い単葉の葉が高品質のプロトプ ラストの大量に起因したと分かった。ペグ カルシウム仲介された変形方法を最適化することにより、大豆含むプロトプ ラストを用いた高い変換効率を達成しました。このシステムは、ライブ ダイズ細胞における複雑な規制とシグナル伝達メカニズムの検討の効率的かつ汎用性の高いモデルを提供し、ヘルプは、マメ科植物の多様な細胞・発達・生理学的なプロセスを理解するかもしれない。

Introduction

プロトプ ラストは、削除される細胞壁を持つ植物細胞です。機能のほとんどは、植物細胞の活動を管理するのでプロトプ ラスト観察・多様な携帯電話イベントを評価する良いモデル系、1体の交配を研究し、植物の再生2する貴重なツールです。プロトプ ラストは、細胞壁がブロックされセルに DNA の通過以来工場変換3,4、5、また広く利用されています。プロトプ ラストは生理学的な応答のいくつか、したがって細胞内タンパク質局在6,7、8を研究する基礎研究の基本的な値を提供して、そのまま植物の細胞プロセスを所有しています。蛋白質蛋白質の相互作用の9,10、プロモーター活動11,12,13ではセルを住んでいます。

196014で最初に報告された植物プロトプ ラストの分離と分離とプロトプ ラストの変形のためのプロトコルを開発し、最適化します。葉の切断と非消化組織破片からリリースされた原形質体の分離に続いて、細胞壁の酵素消化、原形質体の隔離の標準的な手順が含まれます。エレクトロポレーション15,16、マイクロインジェクション17,18、およびポリエチレング リコール (PEG)4,5,19手法変革戦略が含まれています。種の広い範囲は、原形質体の隔離、柑橘類20、アブラナ科21、ナス科22その他の観賞用植物家族23,24を含む成功報告されています。モデル植物シロイヌナズナの葉から分離したシロイヌナズナ葉肉プロトプ ラスト (TEAMP) に一過性発現系が確立した25をされている様々 な種では、多様な組織型が使用されて、多様なアプリケーションに広く採用されています。

大豆 (最高グリシン(l.)ダイズ) 最も重要なタンパク質の 1 つで、油作物26。異なり、シロイヌナズナイネ、遺伝子組み換え大豆の植物を得ることはむしろ困難と低効率に知られています。アグロバクテリウム-仲介された浸潤一般に使用されているタバコ27で表皮細胞およびシロイヌナズナ28,29, 苗の一時的な遺伝子発現研究に対しサツマイモネコブセンチュウは大豆30植物毛状根の変形のために使用されています。ウイルス誘導性遺伝子のサイレンシング アプローチは、ターゲット遺伝子の31,32と過渡式の33のダウンレギュレーションを系統的に利用されています。プロトプ ラストは、貴重な汎用性の高いこれらのアプローチ方法を提供します。プロトプ ラストは大豆の地上材料から得ることが、発現の迅速かつ同期ができます。しかし、1983年34ダイズプロトプ ラストの最初の成功した分離以来報告されている限られた大豆35,36,37,プロトプ ラストの応用38、主にダイズプロトプ ラストの比較的低い収穫のため。

ここでは、ダイズプロトプ ラストの分離のためのシンプルで効率的なプロトコルと一時的な遺伝子発現研究への応用について述べる。ダイズ芽ばえから若い単葉の葉を使用すると、数時間以内の重要なプロトプ ラストの大量を取得することができました。さらに、ペグによるカルシウムの変換法はシンプルで高効率で大豆プロトプ ラストに DNA を提供する低コストを最適化しています。

Protocol

1. 植物の成長 大豆の 5-10 ダイズ種子 (ウィリアムズ 82) 長日条件 (16 h 1,500 µmol m-2の-1光) カスタム土壌ミックスの 25 ° c の下で温室で 13 cm ポットに種をまく (、1: 土、パーライト、魚雷の砂の比率 1:1)。 2. DNA のプラスミッドの準備 滅菌ピペット チップやつまようじを使用すると、単一コロニーを大腸菌興味の遺伝子を含んでい?…

Representative Results

プロトプ ラストの調製 (図 1) を 10 日間の古い大豆のさまざまな器官を調べた (図 2) 顕微鏡下では認められなかった.胚軸, 上胚軸から細胞壁がほとんど消化して、そしていくつかの細胞 (図 2 b, 2 C) 互いに接続されています。子葉 (図 2 D) とルート (図 …

Discussion

ダイズプロトプと一過性発現研究への応用の分離のこのプロトコルは徹底的にテストされており、当研究室では非常にうまきます。手順はシンプルで簡単な一般的な機器を最小コストを必要とされます。我々 のプロトコルは、以前に報告された方法34,35,36,37,38に比べて?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、全米科学財団 (NSF-PGRP IOS-1339388) から植物ゲノム研究プログラムによって支えられました。

Materials

MES Sigma Aldrich  M8250-100G
Cellulase CELF Worthington Biological Corporation LS002611
Pectolyase Y-23 BioWorld 9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10 yakult 10g
MACEROZYME R-10 yakult 10g
Mannitol ICN Biomedicals  152540
CaCl2 Fisher  C79-500g 
BSA NEB R3535S
DTT Sigma Aldrich  D5545-5G
NaCl Sigma Aldrich  S7653-1kg
KCl Fisher  P217-500g 
MgCl2 Sigma Aldrich  M8266-100g
PEG4000 Fluka 81240
nylon mesh carolina 652222N
Tissue Culture Plates  USA Scientific CC7682-7506
Razor Blades Fisher 12-640
hemacytometer hausserscientific 1483
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
EZNA plasmid miniprep kit Omega D6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep Kit Thermo Scientific K0502
Centrifuge 5810 eppendorf 5811000827
Centrifuge 5424 eppendorf 22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet Controller Jencons 14526-202
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss N/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450
15 mL Centrifuge Tubes Denville C1018-P
50 mL Centrifuge Tubes Denville C1060-P
Newborn Calf Serum Thermo Scientific 16010159
Soil Ingram's Nursery
perlite Vigoro 100521091
Torpedo Sand JKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder) Fisher BP1427-500
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Keywords: Soybean ProtoplastsTransient Gene ExpressionRegulatory NetworksProtein InteractionsUnifoliate LeavesEnzyme SolutionVacuum InfiltrationProtoplast DigestionW5 SolutionNylon MeshCentrifugation
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Wu, F., Hanzawa, Y. A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses. J. Vis. Exp. (131), e57258, doi:10.3791/57258 (2018).
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