Summary
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für invasive Messungen der hämodynamischen Parameter einschließlich Portal Druck, splanchnic Blutfluss und systemischen Hämodynamik um das Portal Hypertensive Syndrom bei Ratten zu charakterisieren.
Abstract
Dies ist ein detailliertes Protokoll invasivere hämodynamische Messungen in zirrhotischen Ratten für die Charakterisierung von Portal Hypertensive Syndrom zu beschreiben. Portale Hypertension durch Leberzirrhose (PHT) ist verantwortlich für die schwersten Komplikationen bei Patienten mit Lebererkrankungen. Überblick über das Portal Hypertensive Syndrom zeichnet sich durch erhöhten Portal Druck (PP) aufgrund der erhöhten intrahepatischen Gefäßwiderstand (IHVR), hyperdyname Zirkulation und splanchnic erhöht den Blutfluss. Progressive splanchnic arterielle Vasodilatation und erhöhte Herzleistung mit erhöhter Herzfrequenz (HF), aber niedrigen arteriellen Drucks charakterisiert das Portal Hypertensive Syndrom.
Neuartige Therapien werden derzeit entwickelt, dass Ziel, PP zu verringern durch entweder gezielt IHVR oder erhöhten splanchnic Blutfluss – aber Nebenwirkungen auf systemischen Hämodynamik können auftreten. Eine detaillierte Charakterisierung des Portals venösen, splanchnic und systemische hämodynamischen Parameter, einschließlich der Messung von PP, Portal venösen Blutfluss (PVBF), mesenterialen arterielle Durchblutung, arterielle Mitteldruck (MAP) und HR ist also erforderlich für präklinische Bewertung der Wirksamkeit von neuen Behandlungsmethoden für PHT. Unsere video-Artikel bietet dem Leser mit einem strukturierten Protokoll für die Durchführung von invasiver hämodynamischen Messungen in zirrhotischen Ratten. Vor allem beschreiben wir die Katheterisierung der Femoral Arterie und die Pfortader über eine Ileocolic Ader und die Messung der Portal-venösen und splanchnic Blutfluss über perivaskuläre Doppler-Ultraschall-Durchfluss-Sonden. Repräsentative Ergebnisse der verschiedenen Ratte Modelle der PHT werden angezeigt.
Introduction
PHT ist definiert als krankhaft erhöhtem Blutdruck im Portal Venensystem, die schwere Komplikationen bei Patienten mit Zirrhose wie variceal Blutungen und Aszites1verursachen können. Während Pre-Leber (z.B. Portal Venenthrombose) und Post-Leber (z.B.Budd-Chiari-Syndrom) PHT sind selten, intrahepatischen PHT aufgrund einer Leberzirrhose stellt die häufigste Ursache von PHT2.
In einer Leberzirrhose wird PP in erster Linie als Folge der erhöhten IHVR3erhöht. In fortgeschrittenen Stadien, PHT wird verschärft durch die erhöhte PVBF durch erhöhte Herzleistung und splanchnic und systemischen Gefäßwiderstand sank – das Portal Hypertensive Syndrom4definieren. Ohmsche Gesetz (ΔP = Q * R) impliziert, dass die IHVR und Blut fließen sind proportional zur PP5. Bei Patienten ist die direkte Messung der PP riskant und nicht routinemäßig durchgeführt; Stattdessen wird die hepatische venösen Druckgradienten (HVPG) als indirekte Messung der PP6,7verwendet. Der HVPG errechnet sich durch Subtraktion kostenlose hepatische venendrucks (FHVP) aus dem verkeilten hepatische venösen Druck (WHVP), die mit einem Ballonkatheter platziert in einer Lebervene8gemessen werden. Der physiologische HVPG liegt zwischen 1 – 5 MmHg, während ein HVPG ≥10 MmHg definiert klinisch signifikanten Portale Hypertension (CSPH) und zeigt erhöhtes Risiko für PHT-Komplikationen wie Blutungen variceal, Aszites und Hepatische Enzephalopathie9 . Obwohl PP (d.h., HVPG) der wichtigsten Parameter für Informationen zu anderen Komponenten des PHT, PHT Schweregrad sind einschließlich der Schweregrad der hyperdyname Zirkulation (HR, Karte), splanchnic/mesenterialen arterielle Durchblutung und IHVR, entscheidend für die erhalten Sie ein umfassendes Verständnis für die unterschiedlichen zugrunde liegenden Mechanismus der PHT.
So, im Gegensatz zur indirekten Messungen von PP in Menschen, die eingeführte Methodik für Ratten bietet den Vorteil einer direkten Messung der PP und ermöglicht die Aufnahme von zusätzlichen hämodynamischen Parameter charakterisieren das Portal Hypertensive Syndrom. Darüber hinaus die direkte Messung der PP ist eine hervorragende integrative Auslesen der Höhe der Leberfibrose (ein wichtiger Faktor des IHVR) und gewisse Einschränkungen der Fibrose Quantifizierung im Zusammenhang mit Lebergewebe entnahmefehler überwindet.
Die am häufigsten verwendeten Nager-Modelle der Zirrhotischen PHT gehören chirurgische Gallengang Ligatur (BDL), Toxin-induzierten Leberschädigung (d. h.durch Carbon Titantetrachlorid, Thioacetamide oder Dimethylnitrosamine-Verwaltung) und Diät-induzierten metabolischen Leber Krankheitsmodelle. Prehepatic (nicht zirrhotischen) PHT kann durch partielle Pfortader Ligatur (PPVL)10induziert werden.
Kleine Nagetiere eignen sich gut für die vorgestellte Methode, einschließlich Mäuse, Hamster, Ratten oder Kaninchen, und sind mit relativ geringen Wartungskosten verbunden. Trotzdem sind alle sind die hämodynamischen Bewertungen möglich, führen Sie in Mäuse, bessere Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit Ratten oder größere Nagetiere durch den offensichtlichen Vorteil der Tiergröße gesehen. Darüber hinaus werden spezielle Mikro-Instrumente und Geräte benötigt, ähnlichen hämodynamischen Parameter bei Mäusen zu erhalten. Zu guter Letzt Ratten sind robuster mit niedrigeren assoziierten Morbidität und Mortalität und somit die Drop-out Rate dürften niedriger bei Ratten als bei Mäusen.
Die vorgestellte Methodik eignet sich gut für die Bewertung der spezifischen Behandlungen von Erkrankungen der Leber (z.B. Anti-fibrotischen oder Anti-inflammatory Drogen) oder Roman pharmakologischen nähert sich diesem Einfluss Gefäßtonus und/oder endothelialen Biologie; und so wahrscheinlichen Auswirkungen hämodynamischen Parameter in PHT.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Ethikkommission der medizinischen Universität Wien und der österreichischen Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft (BMWFW) genehmigt. Verfahren muss unter aseptischen Bedingungen in einem OP-Saal durchgeführt oder ähnliche Arbeitsbereich zu reinigen, da die hämodynamischen Messungen chirurgische Eingriffen darstellen. Arbeiten unter sterilen Bedingungen wird generell empfohlen. Bei der Verwendung einer Inhalation Anästhesie betrachten Sie ausreichende Belüftung des OP-Raum für Arbeitssicherheit. Einen Zeitraum von 40 – 50 min/Tier muss im Fall alle hämodynamische anzeigen präsentiert in diesem Protokoll sorgfältig geprüft werden.
1. präoperative Vorbereitungen
- Schalten und die elektronische Mehrkanal Recorder einschließlich der Druckaufnehmer entsprechend Anleitungen des Herstellers zu kalibrieren.
- Die Ultraschall-Durchflussmessung-Sonden (1 mm und 2 mm) an der brückenverstärker anschließen.
- Bereiten Sie ein Reservoir von steriler physiologischer Kochsalzlösung auf Körpertemperatur, 37 ° C, zum Befeuchten von Geweben oder Kompressen Gaze erhitzt.
- Aufzeichnung der Tierkörper Gewicht Gewicht angepasst Anästhesie und Normalisierung der hämodynamischen Parameter entsprechend dem Körpergewicht.
- Alle Ausrüstung für eine Inhalation Narkose vorbereiten.
Hinweis: Wenn Inhalation Anästhesie und/oder notwendige Ausrüstung ist nicht vor Ort oder machbar, Injektion Anästhesie mit Ketamin und Xylazin kann dann genutzt werden (80 – 100 mg/kg Ketamin mit 5 – 10 mg/kg Xylazin in physiologischer Kochsalzlösung, intraperitoneal (i.p.)). Ketamin (reduzierte Dosis von 20-30 mg/kg, intramuskulär (i.m.)) wieder Dosierung nach 30-45 min ist für kontinuierliche operative Ebene Anästhesie unabdingbar. - Setzen Sie das Tier in kurzfristige Isofluran-Narkose mit einer Induktion-Box für die Inhalation Anästhesie (5 min, 5 % V/V Isofluran, 3 – 4 L O2-Fluss). Sorgfältig kippen Sie die Box und prüfen Sie die Tiefe der Narkose durch die Unbeweglichkeit Zustand des Tieres.
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Die Ratte mit einem geeigneten Selfmade endotracheal Schlauch Intubation.
Hinweis: Für Mitarbeiter, die neu in die Intubation Technik, kann der Analgesie/Anästhesie (Schritt 1.10) direkt nach kurzfristigen Inhalation Anästhesie gegeben werden um zusätzliche Zeit für Intubation. Eine weitere Option ist eine Tier-spezifische Gesichtsmaske für die Inhalation Anästhesie.- Verwenden Sie einen selbstgemachten endotrachealen Schlauch aus einem modifizierten peripheren Venenkatheter (14 G). Schneiden Sie den Umgang mit Flügeln und kleben Sie eine Klebeband-Schleife zur posterioren Fixierung an der Ratte Wange, Dislokation des Endotrachealtubus (Abbildung 1A) zu verhindern.
- Verwenden Sie ein Selfmade Anleitung-Draht-Gerät aus einer modifizierten arterielle Kanüle als ein Führer Drahthalter und ein geeigneter stumpfen Spitzen Draht (Abbildung 1 b).
- Verwenden Sie einen geeigneten Intubation Schreibtisch für die richtige Positionierung des Tieres. Legen Sie das Tier in Rückenlage mit dem Kopf in der angewinkelten Position.
Hinweis: Wenn keine Intubation Schreibtisch zur Verfügung steht, ist es möglich, das Tier in Rückenlage mit dem Hals sorgfältig gespannt über die Tischkante legen. Dieses Verfahren wird jedoch nicht durch erhöhtes Risiko für Verletzungen empfohlen. - Beheben Sie eine Naht hinter die Schneidezähne auf der einen Seite der Ratte zu, und dehnen Sie sanft den Hals des Tieres durch das Binden der Naht nach unten auf der anderen Seite (Abbildung 1).
- Bereich Pre trachealen ventralen Kragen mit einer fokussierten Lichtstrahl zu beleuchten. Vor allem bei den Albino Tieren sicherstellen Sie, dass die Stimmbänder durch die Haut, um verbesserte Visualisierung und rasche Intubation können beleuchtet werden.
Hinweis: Verwenden Sie eine Tier-spezifische Laryngoskop für Intubation von pigmentierten Tieren. - Schnappen Sie sich die Zunge und ziehen Sie es vorsichtig mit zwei Fingern.
- Verwenden Sie ein Wattestäbchen mit Lidocain (Pumpspray) behandelt, um den Kehlkopf Bereich sorgfältig zu betäuben.
- Intubation das Tier durch das Einfügen der endotrachealen Schlauch zwischen den Stimmlippen und in der Luftröhre, mit Unterstützung der Draht Führungseinrichtung (Abbildung 1).
- Anleitung-Draht-Gerät zu entfernen.
- Schließen Sie den Schlauch an den Ventilator.
- Starten Sie den Ventilator mit den entsprechenden Einstellungen für das Tier (1 L/min O2-Flow, Auto Flow = 90/min; inspiratorischen Druck: 18 MmHg; PEEP: 3 MmHg, ich / E = 1:2) und suchen Sie nach korrekten Intubation.
Hinweis: Wenn Inflation des Magens vermerkt ist, das Rohr zu entfernen und versuchen Sie es erneut. Darüber hinaus vergleichen Sie die Atmungsaktivität der Ventilator-Rhythmus oder legen Sie zwei Finger auf den Bauch Wand rechts über den Bauch zu beurteilen, mögliche Inflation des Magens.
- Starten Sie Isofluran-Narkose bei 0,5 – 1,0 % V/V und 1 L/min O2-fließen unmittelbar nach erfolgreicher Intubation (Abbildung 2A).
- Befestigen Sie den Endotrachealtubus durch eine transbukkaler-Naht durch die Wange und die angebrachte Klebeband-Schleife des Rohres.
- Verwalten, zusätzliche Anästhesie und Analgesie durch zwei 1 mL Spritzen, z.B., Ketamin (100 mg/kg) i.p (23 G Kanüle) [oder i.m. durch die Verteilung des injizierten Volumens (Dosis) in bilateralen Injektionen in den kaudalen Oberschenkelmuskel (30 G Kanüle)] und Piritramide (2 mg/kg) durch subkutane Injektion (s.c.) (23 G Kanüle). Beachten Sie die maximale Lautstärke des i.m. Injektionen pro Injektionsstelle (Abb. 2 b).
- Gelten Sie Augensalbe. Befestigen Sie die Körperbehaarung im Bauchbereich und beide Innenseiten der Oberschenkel. Desinfizieren Sie die Haut.
Hinweis: Beide Innenseiten der Oberschenkel sollte rasiert werden, um die Verwendung der kontralateralen Femoral Arterie für HR und Karte Messungen ermöglichen, für den Fall, dass die Katheterisierung der Femoral Arterie auf der einen Seite ist fehlgeschlagen. Rasur zu einem späteren Zeitpunkt kann dazu führen, dass Haare um das OP-Feld zu verunreinigen. - Fixieren Sie das Tier in der Rückenlage auf ein Heizkissen (38 ° C) mit Klebeband (Abbildung 2).
- Überwachen Sie die Körpertemperatur des Tieres ständig, z. B.mithilfe eines rektalen Temperaturfühlers (Abb. 2D).
- Bewerten Sie die Tiefe der Narkose, indem Deckel Verschluss reflex und Toe-Pinch-Test vor jeder Intervention oder Operation.
2. Messung des HR und Karte
- Die Haut an der Innenseite des Oberschenkels (Wählen Sie eine Seite) über dem mutmaßlichen Standort der Femoral Arterie durch Anheben der Haut durch Gewebe Zange einzuschneiden und Entfernen von einem Hautareal von ca. 2 cm Länge von Mayo Schere (Abbildung 3A).
- Aussetzen und unverblümt sezieren des Arterie-Vene-Nerv-komplexes, der die Femoral Arterie aus Bindegewebe (Adventitia) enthält durch immer wieder öffnen einer Gefäßklemme entlang des Komplexes.
- Sezieren des Arterie-Vene-Nerv-Komplexes aus dem umgebenden Gewebe entlang ~1–1.5 cm (Abb. 3 b).
- Entfernen Sie ggf. subkutanen/perivaskuläre Fett für eine bessere Sicht und Dissektion.
Hinweis: Seien Sie vorsichtig beim Entfernen von subkutanen/perivaskuläre Fett von Nagelhaut Schere, da verletzte Blutgefäße Blutungen verursachen. Wenn Blutungen vermerkt ist, üben Sie Druck auf den blutenden Bereich mit einer kleinen Gaze oder die Blutung mit einer Gefäßklemme. - Trennen der Femoral Arterie, die femoral Ader und Nerven mit zwei hochpräzise 45° Winkel breiten Punkt Pinzetten (nach Auffassung die femorale Ader ist die am meisten medialen Struktur und die Femoral Arterie liegt mehr seitliche) (Abbildung 3-F).
- Aufsetzen einer Ligatur der Femoral Arterie als distal wie möglich und verwenden eine geschwungene Klammer auf die Naht der Femoral Arterie sanfte längs Traction zuweisen.
- Legen Sie eine zweite Pre-verknotete (aber nicht geschlossene Knoten) Naht auf die Femoral Arterie als proximal als möglich (Abbildung 3).
- Bereiten Sie einen geeigneten Katheter (PE-50 für Ratte Femoral Arterie) mit einer Schräge (~ 45°) Cut-Off-Spitze mit heparinisierten steriler physiologischer Kochsalzlösung (5 mL Spritze und 23 G stumpfen Kanüle) gespült. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Inneren des Katheters sind, da sie den arteriellen Druck und HR auslesen (Abbildung 3 H) behindern.
- Komprimieren Sie die Femoral Arterie am proximalen Ende des exponierten Abschnitt mit einer Mikro-Klemme, um die arterielle Durchblutung (Abbildung 3I) vorübergehend zu stoppen.
- Perforieren der Arterienwand an einer distalen Position des Abschnitts seziert mithilfe einer gebogenen Kanüle (23 G) während des Einsetzens einer unterstützenden Mikro Metallspatel unterhalb der Femoral Arterie (Abbildung 3J).
- Katheterisieren Sie sorgfältig die Femoral Arterie durch die Perforation mit der schrägen Spitze des Katheters nach oben. Voraus, dass der Katheter bis die Mikro-Klemme ist angenähert (Abbildung 3 K).
Hinweis: Im Falle einer erfolglosen Katheterisierung der Femoral Arterie beim ersten Versuch, ein mehr proximaler zweiter Versuch durchgeführt werden kann (beginnen Sie mit Schritt 2,8). Wenn die Arterie Brüche oder schwere Blutungen auftreten, verbinden Sie oder Klemmen Sie die Arterie als proximal wie möglich zur Verhinderung weiterer Blutverlust. Wenn der Blutverlust ist minimal, versuchen Katheterisierung der kontralateralen Femoral Arterie (beginnen Sie mit Schritt 2.1). - Öffnen Sie die Mikro-Klemme und suchen pulsierende arterielle Blutfluss in den Katheter (Abbildung 3 L).
- Verhindern, dass weitere Zustrom von Blut in den Katheter durch die Blockierung des Abfluss des Katheters.
- Befestigen Sie den Katheter am Standort Intraluminal durch Schließen der vorbereiteten proximalen Ligatur um die Femoral Arterie und die eingeführten Katheter (Abbildung 3 M).
- Immer wieder spülen Sie und Aspirieren Sie den Katheter in die Femoral Arterie richtige intravaskulären Platzierung zu beurteilen. Arterielle Pulsation in der Spalte von angesaugte Blut sollte leicht erkennbar sein.
- Fixieren Sie die Katheter Position entlang des Schiffes mit den Enden der distalen Ligatur Luxation entgegenwirken und sicherstellen einer longitudinalen Position des Katheters (Abbildung 3N).
- Zusätzlich mit Klebeband des Katheters in der Nähe des Tieres auf dem OP-Tisch zu sichern und zu verhindern, dass versehentliche Dislokation.
- Verbinden Sie den Katheter mit physiologischer Kochsalzlösung, der Drucksensor gefüllt, während die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
- Die Aufnahme der HR und Karte über die digitale Schnittstelle (Abbildung 3O).
- Die exponierte Fläche auf der Innenseite des Oberschenkels mit einer kleinen angefeuchteten Gaze-Kompresse (Abbildung 3 P).
- Die hyperdyname (HD)-Index berechnen: HD = MAP/HR.
Hinweis: Bei fortgeschrittenen PHT ist der HD-Index im Vergleich zu nicht-Portal Hypertensive Tiere erhöht. Jedoch möglicherweise eine Erhöhung der HD-Index während der Operation auch Blutungen, Hypovolämie oder Schmerzen. Wenn aufgezeichnete MAP-Werte sehr niedrig sind, aber das Signal gut ist und pulsierender Durchfluss in den Katheter erkannt wird, überprüfen Sie, ob das Niveau der Anästhesie und potenziell die Senkung der Anästhesie. Nicht vollständig zu stoppen Isoflurane Narkose, da dies auf unzureichende Anästhesie Tiefe nach Tierschutz und guter wissenschaftlicher Praxis führen kann.
(3) überlegenen mesenterialen Arterie Blutfluss (SMABF)
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Führen Sie eine mediane Laparotomie (Abbildung 4A-C)
- Heben Sie die Hautschicht mit Gewebe Zange 5 – 6 cm unter dem Xiphoid und entfernen ein dünner Streifen der Haut mit einem Mayo Schere oberhalb der Linea Alba bis das Xiphoid erreicht ist.
- In der Mitte der hautinzision, heben die Muskelschicht durch Gewebe Zange entlang der Linea Alba, Abstand zwischen der Bauchdecke und splanchnic Organe zu schaffen.
- Öffnen der Bauchhöhle durch Einritzen der Bauchwand mit einem Skalpell an der Linea Alba. Erweitern Sie die Öffnung beim Anheben der Bauchdecke durch Gewebe-Zange mit einer Metzenbaum Schere entlang der Linea Alba auf der gleichen Strecke wie die Hautschicht.
- Vorsichtig ausheben Sie des Darms mit feuchten Wattestäbchen beginnend mit dem Coecum und legen Sie es auf eine große Gaze-Kompresse getränkt in steriler physiologischer Kochsalzlösung neben Einschnitt (Abbildung 4-F).
- Wickeln Sie den Darm in die Gaze-Kompresse und stellen Sie sicher, dass es mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (Abbildung 4) befeuchtet wird.
- Suchen Sie und setzen Sie die überlegene mesenterialen Arterie.
- Die überlegene mesenterialen Arterie mit zwei selbstgebauten stumpfen "Schwabl" sezieren-Haken: heben Sie die Arterie mit den ersten Haken und versuchen, letzterer durch den gleichen Gewebe-Tunnel statt. Setzen Sie die überlegene mesenterialen Arterie entlang einen 5 mm Abstand um sicherzustellen, dass die Durchfluss-Sonde (1 mm) Drumherum (Abbildung 4-H-K) platziert werden kann.
Hinweis: Falls gewünscht, eine Präzision 45° Winkel breiten Punkt Zange lässt sich die Arterie als auch heben. "Schwabl"-Haken sind aus 30 G Kanülen mit unverblümt gebrochenen Spitzen gebogen, um eine Hakenform vorbereitet. Wenn Sicherheiten Arterien umfangreich sind, die "Schwabl"-Haken möglicherweise sicherer als Blutungen von Sicherheiten, während sezieren die überlegene mesenterialen Arterie vermieden werden kann. Wenn Blutungen auftreten, während der Vorbereitung der überlegenen mesenterialen Arterie, legen Sie eine kleine Gaze Kompresse auf der blutenden Seite für 1 – 2 min. mit sanftem Druck. Kleine Blutungen wird in der Regel schnell zu stoppen; Denken Sie immer daran, Befeuchtung Gewebe in regelmäßigen Abständen (Schritt 1.12). Wenn die überlegene mesenterialen Arterie selbst geschädigt ist, müssen die hämodynamische Beurteilung beendet werden. - Wenden Sie Ultraschallgel auf die Ultraschall-Durchflussmessung Sonde Sensor an und verbinden Sie es mit der splanchnic mesenterialen Arterie. Richten Sie es auf dem natürlichen Weg der überlegenen mesenterialen Arterie (Abbildung 4L-M).
- Schließen Sie die Durchfluss-Sonde (1 mm) und bei Bedarf sanft gelten Sie zusätzliche Ultraschallgel auf dem Doppler Sensor um die Signalqualität zu verbessern. Dazu mit einer Spritze (20 mL) gefüllt mit Ultraschallgel und eine stumpfe Spitze Kanüle (18 G) (Abbildung 4N-O).
Hinweis: Wenn die Durchfluss-Sonde entlang den natürlichen Verlauf des Schiffes nicht gut ausgerichtet ist, kann Spannung verursachen, vaskulären Zusammenziehung und so turbulente Strömung, die die Genauigkeit der Durchflussmessungen reduziert. Versuchen Sie, die Richtung der Strömung Sonde entlang der natürlichen Strecke des Schiffes neu ausrichten und ausreichend befestigen die Durchfluss-Sonde an einer geeigneten Stelle. - Messen Sie die SMABF und bewerten Sie die Übereinstimmung des Signals zu den systolischen Gipfeln der Femoral Arterie Aufnahme pulsierender Durchfluss.
Hinweis: Wenn aufgezeichnete MAP-Werte sehr niedrig sind, aber das Signal gut und pulsierender ist Strömung erkannt in den Katheter, überprüfen Sie, ob das Niveau der Anästhesie und potenziell die Senkung der Anästhesie. Nicht vollständig zu stoppen Isoflurane Narkose, da dies auf unzureichende Tiefe der Narkose nach Tierschutz und guter wissenschaftlicher Praxis führen kann. - Finden Sie eine stabile Position der Durchfluss-Sonde (1 mm) und befestigen Sie das Kabel der Durchfluss-Sonde. Starten Sie die SMABF ohne weitere Manipulation der Durchfluss-Sonde (1 mm) (Abbildung 4 P).
(4) PVBF
- Suchen Sie und setzen Sie die Pfortader an der dorsalen Mesenterium, in der Nähe der Leber Hilum (Abb. 5A).
- Die Pfortader aus dem umgebenden Gewebe mit einer hochpräzisen 45° Winkel breiten Punkt Pinzette sanft sezieren: Isolieren der Pfortader durch sanft und wiederholt drücken die Zange unter die Pfortader erstelle ich einen Gewebe-Tunnel (Abbildung 5 b).
Hinweis: Tritt eine Blutung aus dem Periportal Gewebe während der Vorbereitung der Pfortader, üben Sie sanften Druck auf die blutende Website für 1-2 min mit einem Wattestäbchen; Dies verhindert oft die Blutung. - Vergrößern Sie den Tunnel durch die hohe Präzision 45° Winkel breiten Punkt Zange langsam öffnen und setzen Sie die Pfortader auf einer Strecke von ca. 5-6 mm ermöglichen die Platzierung des Prüfpunkts perivaskuläre Fluss (2 mm) (Abbildung 5, D).
- Der Ultraschall-Durchflussmessung Sonde Sensor Ultraschallgel auf und hängen Sie es an die Pfortader mit seinen natürlichen Weg (Abb. 5E) ausgerichtet.
- Schließen Sie die Durchfluss-Sonde (2 mm) und gelten zusätzliche Ultraschallgel bei Bedarf, wie zuvor beschrieben (Schritt 3,7) (Abb. 5F).
- Achten Sie darauf, dass die Durchfluss-Sonde ist in eine nicht einengende Weise um die Pfortader (Abbildung 5).
Hinweis: Wenn die Durchfluss-Sonde entlang den natürlichen Verlauf des Schiffes nicht gut ausgerichtet ist, kann Spannung verursachen, vaskulären Zusammenziehung und so turbulente Strömung, die die Genauigkeit der Durchflussmessungen reduziert. Versuchen Sie, die Richtung der Strömung Sonde entlang der natürlichen Strecke des Schiffes neu ausrichten und ausreichend befestigen die Durchfluss-Sonde an einer geeigneten Stelle. - Finden Sie eine stabile Position der Durchfluss-Sonde (2 mm) und befestigen Sie das Kabel der Durchfluss-Sonde. Starten Sie dann die Aufzeichnung der PVBF (Abbildung 5 H).
Hinweis: Wenn aufgezeichnete MAP-Werte sehr niedrig sind, aber das Signal gut und pulsierender ist Strömung erkannt in den Katheter, überprüfen Sie, ob das Niveau der Anästhesie und potenziell die Senkung der Anästhesie. Nicht vollständig zu stoppen Isoflurane Narkose, da dies auf unzureichende Tiefe der Narkose nach Tierschutz und guter wissenschaftlicher Praxis führen kann.
5. PP
- Bereiten Sie einen Katheter (PE-50 für Ratten mesenterialen Adern) mit einem schräg (ca. 45°) Cut-Off-Spitze, die mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (5 mL Spritze und stumpfen Kanüle 23 G) geleert wird. Achten Sie darauf, das keine Luftblasen im Inneren des Katheters sind, wie sie das PP auslesen (Abb. 6A) behindern.
- Behandeln Sie den Darm mit nassen Handschuhe und legen Sie es über Finger (Abb. 6 b) verteilt.
- Optimieren Sie die Ansicht des mesenterialen vaskulären Bettes in der Nähe des Dünndarms (Abbildung 6).
- Identifizieren Sie die wichtigsten venösen mesenterialen Gefäße führt zu die Pfortader (Vena Ileocolica - Vena Mesenterica Superior - Vena Portae).
- Finden Sie eine geeignete Kreuzung der Ileocolonic Ader, die zur Katheterisierung zugänglich ist.
- Zunächst bleiben des Katheters in den mesenterialen Gewebe durch Perforation der viszeralen Peritoneums das Mesenterium nah an der vaskulären Kreuzung zur Katheterisierung gewählt.
- Sorgfältig die abgeschrägte Spitze des Katheters näher an einer Kreuzung der Ileocolic Vene vorschieben, bis ein leichter Eindruck von der Kreuzung Schiff gesehen wird (Abbildung 6).
- Zu guter Letzt katheterisieren Sie das venöse System im Einklang mit der Verbindungstechnik Schiff Route durch Perforation der Gefäßwand an der Kreuzungswinkel der Schiffe. (Abb. 6E).
Hinweis: Wenn Blutungen an der Katheterisierung der Ileocolic Ader auftritt, mit Hilfe einer Daumen-Presse mit einer kleinen Gaze Kompresse auf die blutende. Dieser Druck aufrechterhalten werden für 1 – 2 min. um die Blutung zu stoppen. Danach versuchen Sie, den Katheter im mehr proximalen Teil der Vene Ileocolic einfügen. - Fördern Sie den Katheter vorsichtig weiter entlang der venösen Hauptschiff Route in die Pfortader ohne Perforation der Vene (Abbildung 6F).
Hinweis: Halten Sie den Katheter in ausreichender Entfernung die Durchfluss-Sonde platziert um den wichtigsten Ast der Pfortader Artefakte im Flow Signal zu vermeiden und zu verhindern, dass die Perforation der portalader. - Verbinden Sie den Katheter mit physiologischer Kochsalzlösung, der Drucksensor gefüllt, während die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
- Die Aufnahme der PP.
- Notieren Sie alle hämodynamischen Parameter gleichzeitig unter stabilen Bedingungen für mehrere Minuten (Abbildung 6, H). Optional das Portal Venenkatheter mit Gewebekleber fixiert werden kann und die Eingeweide in die Bauchhöhle erneut befinden können.
Hinweis: Wenn aufgezeichnete MAP-Werte sehr niedrig sind, aber das Signal gut und pulsierender ist Strömung erkannt in den Katheter, überprüfen Sie, ob das Niveau der Anästhesie und potenziell die Senkung der Anästhesie. Nicht vollständig zu stoppen Isoflurane Narkose, da dies auf unzureichende Tiefe der Narkose nach Tierschutz und guter wissenschaftlicher Praxis führen kann.
6. IHVR
- Messen Sie nach dem Tier zu Opfern die Leber Gewicht. Berechnen Sie die IHVR: IHVR PVBF Wert auf das Gewicht der Leber = PVBF/s. zu normalisieren.
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Representative Results
Je nach Tiermodell und die Schwere der Lebererkrankung ist der Grad der PHT und Schweregrad des Syndroms Portal Hypertensive verschiedene (Abbildung 7).
Das Modell BDL verursacht biliäre Zirrhose durch Cholestase. Entsprechend, PP nimmt im Laufe der Zeit und eine hyperdyname Zirkulation entwickelt, wie durch eine Erhöhung des HR und Abnahme der Karte zu sehen. In zirrhotischen Tiere erhöhen SMABF, PVBF und IHVR auch übereinstimmend auf die hepatischen und hämodynamischen Veränderungen (Abb. 7A–F).
Im Gegensatz dazu verursacht die PPVL prehepatic, nicht zirrhotischen PHT, charakterisiert durch eine sofortige Erhöhung PP und entsprechende Änderungen im systemischen Hämodynamik (Abbildung 7-ich). Jedoch während der Zeitverlauf LEBERSTOFFWECHSEL Sicherheiten entwickeln Sie die PP senken kann.
Die hämodynamischen Werte der Schein betrieben Tiere auf physiologischer Ebene bleiben und im Laufe der Zeit nicht wesentlich verändern. Der Portal Druck bei gesunden Tieren SO ist auf maximal 5 bis 6 MmHg (Abb. 7J-L).
Abbildung 1: self-made Intubation Geräte: (A) Endotracheal Schlauch. (B) Suchkabel Gerät (C) Intubation Schreibtisch. (D) Schlauch befestigt an Führungseinrichtung Draht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: präoperative Vorbereitungen: (A) Intubation des Tieres. (B) Intramuscular und subkutane Injektion für die Anästhesie. (C) Fixierung des Tieres auf Heizmatte. (D) platzieren und rektale Temperatursonde fixieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Herzfrequenz (HF) und mittleren arteriellen Druck (MAP): (A) Schnitt der Haut. (B) Vorbereitung der femoralen Gefäß- und Nervenstrukturen. (C–F) Dissektion der Femoral Arterie. (G) distale Naht und Fixierung - proximalen Pre-Knoten proximale Naht. (H) Vorbereitung der femorale Katheter. (ich) Platzierung der vaskulären Mikro Klammer. (J) Perforation der Femoral Arterie mit einer Biegung Nadel. (K) Katheterisierung der Femoral Arterie. (L) Eröffnung der Mikro Klammer für die Bewertung des Pulses. (M) proximale Fixierung des Katheters. (N) distale Fixierung des Katheters. (O) Messung der Karte und HR. (P) für das OP-Feld mit kleinen getränkten Gaze zu komprimieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: überlegenen mesenterialen arterielle Durchblutung (SMABF): (A–C) Mediane Laparotomie. (D) Ausgrabung der Coecum. (E–F) Ausgrabung des Darmes. (G) Umhüllung des Darmes in getränkten Gaze komprimieren. (H–K) Vorbereitung der splanchnic mesenterialen Arterie mit stumpfen Kanüle Haken. (L, M) Befestigung der Durchfluss-Sonde. (N) Anwendung von Ultraschall-gel auf die Sonde Durchflusssensor. (O) korrekt "nicht einengende" Platzierung der Durchfluss-Sonde. (P) Messung der SMABF. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Portal venösen Blutfluss (PVBF): (A) optimierte dorsalen anzeigen auf Pfortader (B) Dissektion der Pfortader aus mesenterialen Fettgewebe. (C) Erstellung eines Gewebes Tunnels für die Pfortader-Durchfluss-Sonde. (D, E) Befestigung der Durchfluss-Sonde zur Pfortader. (F) Anwendung von Ultraschall gel auf die Sonde Durchflusssensor. (G) "nicht einengende" korrekte Platzierung der Durchfluss-Sonde. (H) Messung der PVBF. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Portal Druck (PP): (A) Vorbereitung des Katheters. (B) Vorbereitung des Darms. (C) optimierte Blick auf die wichtigsten mesenterialen venösen Gefäßsystem. (D) Perforation des viszeralen Peritoneum und Weiterentwicklung des Katheters näher an geeigneten vaskulären Zweiges. (E) Katheterisierung der Ileocolic Ader in Kreuzung Winkel zwischen den Hauptast und einem Seitenast. (F) Förderung der Katheterspitze in die Pfortader zur Leber Hilum näher. (G, H) Messung von s. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Vertreter Ergebnisse: Zeitlicher Verlauf (A) PP, (B) Karte und (C) HR bei BDL Ratten. Dementsprechend werden Änderungen in (D) SMABF, (E) PVBF und (F) IHVR beobachtet. In der PPVL sind die hämodynamische Veränderungen der PP (G), (H) Karte und (ich) HR in den ersten Tagen nach der Operation am stärksten ausgeprägt. Sham betrieben-gesund (SO) Tiere, (J) PP, (K) Karte und (L) HR im physiologischen Werte bleiben und nicht im Laufe der Zeit ändern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
PP ist das Hauptergebnis Parameter zur Bewertung des Portals hypertensiven Syndroms und spiegelt die Schwere der zugrunde liegenden Leberzirrhose. Matrix Deposition (d.h. Fibrose) und sinusförmigen Vasokonstriktion (aufgrund der erhöhten hepatischen Expression von vasokonstriktoren und verringerte Reaktionsfähigkeit auf Vasodilatatoren) verursachen erhöhte IHVR. Die Bedeutung von PP und ihre Auswirkungen auf die chronische Lebererkrankung nachweislich in mehreren präklinischen11,12,13,14 und klinischen Studien15,16, 17 , 18. daher in cirrhotic Patienten PP ist eine harte Ergebnis-Parameter und die Reduktion ist von Behandlung Leitlinien19,20 und wichtigste Forschungsziel der aktuelle Hepatologie empfohlen. Umfassende Tiermodelle sind erforderlich, zu charakterisieren und16,21 neuartige Behandlungsmöglichkeiten von PHT22zu übersetzen. Dieses Protokoll stellt die Methodik für eine detaillierte hämodynamische Charakterisierung, einschließlich Bewertung des Portals Druck, hyperdyname Zirkulation, splanchnic Vasodilatation und intrahepatischen Widerstand benötigt. Um eine repräsentative und volle hämodynamische Datensatz von Nager-Modelle zu erreichen, ist Erfahrung und Ausbildung des Operators Leistung von größter Bedeutung.
Verhütung und Bekämpfung von schweren Blutungen sind vor allem Schlüsselqualifikationen. Stumpfe und präzise Vorbereitung der vaskulären Abschnitte von Interesse ist entscheidend um Kanülierung Ausfälle und schwere Blutungen zu vermeiden. Erheblichen Blutverlust hat Auswirkungen auf die Hämodynamik und genaue Messungen der PP schließt oder vielleicht sogar führen zum Tod des Versuchstieres. Dokument-Blutungen, die aufgetreten während der Messungen in den Protokollen und der schwere und Lokalisation der Blutung zu charakterisieren.
Der Hinweis mit Ultraschallsonden Fluss perivaskuläre Blutfluss beurteilen erzeugt nur eine Annäherung und Ablesefehler durch unterschiedliche Schiffsgrößen und falsche Sonde Ausrichtung unterworfen werden könnte. Eine andere Technik, Durchblutung und vor allem Blutfluss Vertrieb (einschließlich Berechnung der LEBERSTOFFWECHSEL rangieren) zu messen ist die farbige Mikrosphären Technik23. Jedoch ganze Organe geerntet, aufgelöst und analysiert werden müssen, und dies lässt die Möglichkeit zur histologischen durchführen oder Expressionsanalyse. Daher die Ultraschalltechnik unterstützt die Prinzipien der "Drei Rs" in Tierversuchen (reduzieren, verfeinern und ersetzen) von Russell und Burch24. Darüber hinaus eignen sich Fluss Sonden splanchnic Blutfluss in Echtzeit und parallel zu anderen hämodynamischen Parameter überwachen, während die farbigen Mikrosphären Technik erfordert Orgel (mesenterialen) Blutfluss im Laufe der Zeit zu integrieren. Zudem farbige Mikrosphären, die in der Regel haben einen Durchmesser von 15 µm, erfordern eine Normalverteilung der Mikro-Schiffe mit einem Durchmesser < 15 µm in den jeweiligen Organen zu vermeiden, immer gefangen und unbeweglich, die der Fall in zirrhotischen Lebern möglicherweise nicht.
Die wichtigste Einschränkung dieser Methode ist die Notwendigkeit für einen Zustand der Bewusstlosigkeit und Anästhesie während die hämodynamische Charakterisierung der PHT-Syndrom bei Tieren. Die häufigste und am weitesten verbreiteten Injektion Betäubung Ketamin/Xylazin erfordert oft eine Nachdosierung nach 30-45 min zu einer notwendigen Tiefe Narkose25,26; Dies fügt Zeitdruck, vor allem wenn Problembehandlung erforderlich ist. Mit Inhalation Anästhesie beinhaltet viele Vorteile, aber besondere Ausrüstung ist erforderlich, und Sicherheit Regelungen im Zusammenhang mit volatilen Anästhetika müssen befolgt werden. Die Tiefe der Narkose kann schnell angepasst werden, ohne die Eingriffe durch die Anpassung der Anästhesie-Konzentration zu stören. Der Endotrachealtubus sichert Airways vor allem nach Aktivierung des Heils von Ketamin und die Belüftung sorgt für genügend Oxygenierung und Belüftung des Tieres, das Risiko einer Anästhesie-induzierte Tod27zu senken. Während Ketamin/Xylazin immer noch weit verbreitet ist verursacht gebraucht, niedrig dosierte Isoflurane Narkose keine signifikanten Veränderungen der hämodynamischen oder Herz-Kreislauf-Parameter in Ratten28,29.
Erfahrung vor Ort und Verordnungen bieten spezifische Empfehlungen und bewährte Methoden der Anästhesie und die Forscher kontinuierlich die Art der Anästhesie zur Durchführung dieser hämodynamischen Bewertungen30überdenken müssen. Zukünftige Experimente können Telemetrie mit implantierten drahtloser Druckaufnehmer, die Überwindung der aktuellen Einschränkungen im Zusammenhang mit allgemeinen Narkose und erlauben hämodynamische Charakterisierung der bewussten Tiere.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken den Tierärzten, Krankenschwestern und Tierpfleger am Zentrum für biomedizinische Forschung für ihre kontinuierliche Unterstützung während unserer Forschungsprojekte. Die Autoren erkennen die wichtigen Input von allen Bearbeitern dieses Protokolls. Einige der Forschung wurde finanziert durch die "Young Science Award" von der österreichischen Gesellschaft für Gastroenterologie und Hepatologie (ÖGGH), PS und dem "Skoda Award" der österreichischen Gesellschaft für Innere Medizin, TR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| LabChart 7 Pro software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Software |
| ML870 PowerLab 8/30 | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Electronic multichannel recorder |
| MLT0380/D | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Pressure transducer (x2: for Portal Pressure and Arterial Pressure) |
| ML112 Quad Bridge Amplifier | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Bridge amplifier |
| TS420 | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | - | Flowmeter module |
| Biological Research Apparatus 7025 | UGO BASILE S.R.L., Comerio, Italy | - | Ventilator |
| Vapor 2000 | Dräger Medical AG & Co. KG, Lübeck, Germany | - | Isofluran Vaporizer |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Superior Mesenteric Artery) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA1PRB | Ultrasonic flow probe (1mm) |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Portal Vein) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA2PSB | Ultrasonic flow probe (2mm) |
| 1st for intubation & 2nd for clean skin incisions | - | - | Mayo scissor [x2] |
| Metzenbaum scissor | - | - | - |
| Cuticle scissor | - | - | - |
| e.g. Adson Brown tissue forceps | - | - | Tissue Forceps |
| High precision 45° angle broad point forceps [x2] | - | - | - |
| Hemostat [x4] | - | - | - |
| e.g. Mikulicz peritoneal clamp | - | - | Curved clamp |
| e.g. Dieffenbach clamp | - | - | Micro clamp |
| e.g. micro spatula with flat ends, width 4 mm, | - | - | Micro metal spatula |
| for transbuccal suture at intubation | - | - | Needle holder |
| Scalpel grip | - | - | - |
| selfmade | - | - | Intubation desk |
| blut, flexible and with a suitable diameter for arterial cannula and venflow | - | - | Blunt steel wire |
| modified arterial line 20G with Flowstich | Becton Dickinson, Farady Road, Swindon, UK | #682245 | Arterial line |
| Heating pad | - | - | - |
| Rectal temerature probe | - | - | - |
| Saline heater | - | - | - |
| Laryngoscope (specific for animal size, e.g. rat) | - | - | - |
| Inductionbox for inhalation anesthesia | - | - | - |
| Scale (able to measure mg) | - | - | - |
| Hair clipper | - | - | - |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| e.g. modified BD Venflon Pro Safety 14GA | Becton Dickinson Infusion Therapy, AB, SE251 06 Helsingborg, Sweden | #393230 | Peripheral venous catheter (14G) |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, ID 0.58mm, OD 0.96mm, Portex, | Smiths Medical International Ltd., Kent, UK | #800/100/200 | Catheter tube (PE-50) |
| e.g. Omnifix-F Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #9161406V | Syringe 1mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606051V | Syringe 5mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606205V | Syringe 20mL |
| e.g. BD Microlance 3, 18G - 1 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304622 | Cannula (18G) |
| e.g. BD Microlance 3, 23G - 1" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #300800 | Cannula (23G) |
| e.g. BD Microlance 3, 30G - 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304000 | Cannula (30G) |
| e.g. Leukoplast S | BSN medical GmbH, Hamburg, Germany | #47619-00 | Adhesive tape |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (18x8cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10972 | Gauze compress (small) |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (5x5cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10961 | Gauze compress (big) |
| Silk Braided black, USP 4/0, EP 1.5 | SMI AG, St. Vith, Belgium | #2021-04 | Suture (Silk 4/0, EP 1.5) |
| e.g. Mersilk, 2-0 (3 Ph. Eur.), PS-1 Prime | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Germany | #EH7552 | Transbuccal suture |
| e.g. Cottonbuds (2.2mm, 15cm) | Paul Hartmann AG, Heidenheim, Germany | #967936 | Cotton buds |
| e.g. Vue Ultrasoundgel | Optimum Medical Limited, UK | #1157 | Ultrasound gel |
| e.g. Glubran 2 | Gem srl, Viareggio, Italy | #G-NB2-50 | Tissue glue |
| e.g. Surgical scalpell knife Nr. 10 - carbon steel | Swann-Morton, England, B.S. | #202 | Scalpel Knife |
| Heparin, 5000 i.E./mL (Natriumheparin) | Medicamentum Pharma GmbH, Allerheiligen im Mürztal, Austria | - | Heparin |
| Florane | Aesica Queenborough Ltd., Queenborough, UK | - | Isoflurane |
| OeloVital (5g) | Fresenius Kabi Austira Gmbh, Graz, Austria | - | Eye gel |
| Ketasol | aniMedica GmbH, Senden-Bösensell, Germany | - | Ketamine |
| Rompun | Bayer Austria Ges.m.b.H., Vienna, Austria | - | Xylazine |
| Xylocain 10% Pumpspray | AstraZeneca Österreich GmbH, Vienna, Austria | - | Lidocaine pump spray |
| Dipidolor | Jansen-Cilag Pharma GmbH, Vienna, Austria | - | Piritramide |
| NaCl 0.9% Fresenius, 1L | Fresenius Kabi Austira GmbH, Graz, Austria | #13LIP132 | Physiological saline solution |
References
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