השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון
Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להשיג את השומנים droplet אינדקס (אינדקס LD) ללמוד את הדינמיקה של triacylglycerols בתאים בתרבית בניסויים תפוקה גבוהה. LD אינדקס וזמינותו היא שיטה קלה ומהימנה של המשתמשת BODIPY 493/503. Assay הזה אינו צריך שאיבת השומנים dispendious או ניתוח מיקרוסקופ.
Abstract
המאמר מראה כיצד ליישם את הבדיקה אינדקס LD, אשר הוא רגיש microplate assay כדי לקבוע את הצטברות triacylglycerols (TAGs) בטיפות השומנים (LDs). אינדקס LD מתקבל ללא חילוץ השומנים. היא מאפשרת מדידה התוכן LDs בניסויים תפוקה גבוהה בתנאים שונים כגון צמיחה עשיר או חנקן דלה מדיה. אף על פי השיטה שתוארה לראשונה לחקור את חילוף החומרים של השומנים droplet של האפייה, הוחל בהצלחה אל basidiomycete פחמון זקן התירס. מעניין לציין, כי LDs organelles phylogenetically שמור ב התאים האיקריוטים, השיטה וניתן להחילם למגוון גדול של תאים, מ שמרים בתרבית של תאים. מדד LD מבוססת על וזמינותו שחזור פלורסצנטיות נוזלי (LFR) של BODIPY 493/503 בתנאים שכבתה, על ידי התוספת של תאים קבוע עם פורמלין. יוד האשלגן משמש כ’חטיף זריחה. היחס בין זריחה על המדרונות צפיפות אופטית נקרא מדד LD. מדרונות מחושבים מתוך הקווים ישרים מתקבל כאשר BODIPY פלורסצנטיות, צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) מותוות נגד מדגם תוספת. איכות הנתונים אופטימלית משתקף על ידי מקדמי המתאם שווה או מעל 0.9 (r ≥ 0.9). מספר דוגמאות ניתן לקרוא בו זמנית כמו זה ניתן להטמיע את microplate. מאחר BODIPY 493/503 פלורסנט lipophilic לצבוע את המחיצות לתוך טיפות השומנים, ניתן להשתמש בסוגים רבים של תאים שנצברים LDs.
Introduction
השומנים טיפות (LDs) הינם גופים שומן תאיים בכל מקום מורכב גרעין של שומנים נייטרלי, בעיקר תגיות, סטרול אסטרים (SE). הליבה מוקף טפט של פוספוליפידים המקיימת אינטראקציה עם חלבונים כמו perilipin ואנזימים המעורבים הסינתזה של שומנים נייטרלי, כגון diacylglycerol ליפיד-טרנספראז, אצטיל קואנזים a קרבוקסילאז ו ליפיד-CoA סינתאז1. בשל התנהגות דינמית שלה, טפט פוספוליפיד מכיל גם lipases triacylglycerol זה hydrolyze תגיות ו- SE2. בהתאם לסוג התא באורגניזם, ליפידים נייטרלי מאוחסנות יכול לשמש כדי לייצר אנרגיה, או לסנתז phospholipids ו מולקולות איתות. שמרים ופטריות אחרים, התוכן של LDs משתנה בתגובה בווריאציות יחס פחמן/חנקן בתקשורת תרבות, המציין כי חנקן ירידה בזמינות עשוי להיות המפתח כדי להגדיל את השומנים נייטרלי ייצור3,4 ,5. הייצור של כמויות גבוהות של תגים בשמרים יש שימוש פוטנציאלי בביוטכנולוגיה כמקור של דלק ביולוגי, בתעשיית המזון. כמה שומנים מאוחסנות מכילים הפרופורציות גבוהה של חומצות שומן רב בלתי רווי, כמו אומגה 3 ואומגה 6, עם חשיבות התזונתיים וההתפתחותיים 6,7,8,9,10 , 11. LDs בתרבית של תאים, כולל תאים אנושיים, גם להכיל תגי ואסטרים כולסטרול. טפט פוספוליפיד אינטראקציה עם מידע יונקים הומולוגיים של החלבונים שמתואר שמרים LDs, ועם חלבון נוסף, perilipin, אשר נעדר cerevisiae ס12. אחד הציע תפקיד עבור טפט פוספוליפיד וחלבונים הקשורים שלה הוא לייצב את המבנה LDs ולאפשר את האינטראקציה של תעודות זהות עם organelles כמו המיטוכונדריה, רשתית תוך-פלזמית, peroxisomes וקואלות, בעיקר עבור exchange השומנים 13,14. מעניין, בבני אדם, LDs מופיעים להיות מעורב פתולוגיות כמו סוכרת מסוג 2, טרשת עורקים, steatohepatitis מחלת לב כלילית, בהם יש גידול שלהם מספר 15,16,17 . כמה סוגים של וירוסים להשתמש LDs פלטפורמות להרכיב את18, 2,virions19.
בשל ההשלכות של זיהוי פתולוגיות האנושי ולהשתמש ביוטכנולוגי הפוטנציאלי שלהם, בקביעה ניסויית המדויק של היווצרות LDs היא משימה חשובה. מאמר זה מתאר וזמינותו אמין המבוסס על החזרתה של זריחה (LFR) של BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-בורה-3a, 4a-diaza-s-indacene), כדי לקבל ערך היחסי של התוכן של ליפידים נייטרלי בתאים. עם זה assay, זה אפשרי לעקוב אחר הדינמיקה של ההצטברות של שומנים נייטרלי בפטריות כמו זקן התירס בארצות הברית ו cerevisiae ס, וגם בתרבית של תאים, ללא הצורך של השומנים החילוץ 20. השיטה הוחל לראשונה ב cerevisiae ס כדי לזהות את חלבון phosphatases, kinases מעורב ברגולציה של חילוף החומרים של השומנים. זה היה אפשרי ללא שאיבת שומנים בדם או חלבון טיהור21,22. LFR גם שימש כדי לבסס את הדינמיקה של היווצרות LDs מקרופאגים הצפק23. השימוש של BODIPY 493/503 יש כמה יתרונות לעומת אחרים צבעים ניטרליים השומנים כמו הנילוס אדום. BODIPY 493/503 הוא מאוד ספציפי ליפידים נייטרליים ויש ספקטרום פליטה צר, הקלת הגילוי סימולטני של אותות צבע כמו חלבון פלואורסצנטי אדום או Mito-גשש, כאשר הדגימות מנותחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. למרבה הצער, רגיש/ה photobleaching BODIPY 493/503, אך תהליך זה ניתן למנוע על-ידי שימוש של ריאגנט antiquenching במהלך חשיפה אור24.
כדי לבצע את הבדיקה LFR בתאים שמרים, הם בתרבית בתנאים תזונתי הרצוי, aliquots הם מסוגר בזמנים שונים. בשלב הבא, תאים קבועים עם פורמלין, השומרת על היושרה של LDs חודשים כאשר תאים מאוחסנים ב 4 º C. טכניקות קיבוע אחרות יש להימנע, במיוחד אלה באמצעות מתנול או אצטון קר, שכן הן יובילו ההשפלה של LDs בתוך תאים24. כדי למדוד את האינדקס LD, תאים פורמלדהיד-קבוע מושעים במים בריכוז מוגדרים. לאחר מכן, הם מתווספים פתרון המכיל את fluorophore BODIPY 493/503 מתרצה מאת KI, כאשר fluorophore חודרים לתא ומשייך תעודות זהות, יש החלמה של זריחה שלה. במקביל למדידה קרינה פלואורסצנטית (485 nm/510 ננומטר), הריכוז של תאים הוא לכמת על ידי מדידת צפיפות אופטית על 600 ננומטר. כל מדגם נקראים ארבע פעמים על-ידי הוספת אותו aliquots µL 5 עוקבות של השעיה תא פורמלדהיד-קבוע טוב. כדורי סרק של זריחה, ספיגת נרכש לפני התוספת של תאים. האיכות של זריחה ואת הנתונים ספיגת יוערכו על-ידי קביעת על ליניאריות של המדידות: אם r < 0.9, הנתונים יימחקו. הערך חשוב כי בעיקרון עוצמת קרינה פלואורסצנטית צריך לייצר תגובה לינארית הגדלת ריכוזים התא. אם התא ריכוז גבוה מדי, ליניאריות אובד. וזמינותו LFR מספק שיטה מהירה, פשוטה וכלכלית כדי לבחור את פנוטיפ LD הרצוי בניסויים תפוקה גבוהה. לאחר בחירת התנאים הרצויים, LD התוכן של תאים בודדים ניתן יהיה ללמוד על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, באמצעות פורמלין-קבוע לאותם תאים מוכתם BODIPY, מתן תמונה של LDs בתא. שלהם תגים ותוכן SE יכול עכשיו להיות בהמשך נותחו על ידי שכבה דקה כרומטוגרפיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
LFR היא שיטה שהוחל בפעם הראשונה ללמוד מטבוליזם השומנים ב cerevisiae ס ומעלה זה היה בהצלחה מיושמת ב- U. זקן התירס20,21. למרות מדד LD אינו נותן בערכו המוחלט של תגי שהצטברו בתאים, הוא מספק רעיון מהיר של התוכן השומנים של תאים, הפרשנות של הנתונים היא פשוטה כאשר אינד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים אינסטיטוטו Politécnico Secretaria נאסיונאל דה Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Apoyo דה פרוגרמה e Proyectos דה Investigación Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(אוניברסיטת נאסיונאל Autónoma de México UNAM), ו- y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Tecnología (CONACyT 254904-JPP ו- 256520-GGS). Fundação דה אמפרו Pesquisa לעשות את ריו דה ז’ניירו (FAPERJ-Cientistas לעשות Nosso Estado: E 26/103.353/2011). אנחנו הודות QFB. אוסקר Iván Luqueño Bocardo עבור סקירה סכמטי. אנו מודים ד ר מיגל Tapia רודריגס על העזרה יקר מיקרוסקופיה קונפוקלית של תעודות זהות. אנו מאחלים תודה ד ר ברונו Bozaquel Morais על עבודתו החלוצית בחקר פיתוח הטכניקה cerevisiae ס זה אנחנו מותאם זקן התירס בארצות הברית.
Materials
| Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
| Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
| Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
| Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
| Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
| N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
| Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
| Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
| Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
| Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
| Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
| Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
| mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |
References
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
- Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
- Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
- Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
- Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
- Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
- Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
- Kolouchova, I., Mat’atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
- Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
- Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
- Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
- Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
- Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
- Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
- Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
- Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
- Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
- Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
- Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Holliday, R., King, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. , 575-595 (1974).
