Summary

Determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno Ustilago Maydis

Published: April 03, 2018
doi:

Summary

Aquí, describimos un protocolo para obtener el lípido gotitas índice (LD) para estudiar la dinámica de triacilgliceroles en las células cultivadas en experimentos de alto rendimiento. El ensayo de índice de LD es un método sencillo y fiable que utiliza BODIPY 493/503. Este ensayo no es necesario dispendious extracción o análisis de la microscopia.

Abstract

El artículo muestra cómo implementar el ensayo de índice de LD, que es un ensayo de microplacas sensible para determinar la acumulación de triacilgliceroles (etiquetas) en gotitas del lípido (LDs). Índice de LD se obtiene sin extracción. Permite medir el contenido de LDs en experimentos de alto rendimiento bajo diferentes condiciones tales como crecimiento en ricos o media de nitrógeno agotado. Aunque el método fue descrito por primera vez estudiar el metabolismo de la gota de lípido en Saccharomyces cerevisiae, fue aplicado con éxito a los basidiomicetos Ustilago maydis. Curiosamente, y debido a LDs son organelos filogenéticamente conservados en las células eucariotas, el método puede aplicarse a una gran variedad de células, de levadura para células de mamífero. El índice de LD se basa en el ensayo de recuperación de líquido de la fluorescencia (LFR) de BODIPY 493/503 bajo condiciones de amortiguamiento, mediante la adición de células fijadas con formaldehído. Yodo de potasio se utiliza como un extintor de la fluorescencia. La relación entre la fluorescencia y las laderas de la densidad óptica se denomina índice de LD. Pendientes se calculan a partir de las líneas rectas que se obtienen cuando BODIPY fluorescencia y densidad óptica a 600 nm (OD600) se grafican contra la adición de la muestra. Datos óptima calidad se refleja por coeficientes de correlación igual o superior a 0,9 (r ≥ 0.9). Muestras múltiples se pueden leer al mismo tiempo como se puede implementar en una microplaca. Desde BODIPY 493/503 es un lipofílico fluorescente tinte particiones en las gotitas de lípidos, puede ser utilizado en muchos tipos de células que se acumulan de LDs.

Introduction

Gotitas del lípido (LDs) son cuerpos de grasa intracelulares ubicuos compuesto por un núcleo de lípidos neutros, principalmente etiquetas y ésteres de esterol (SE). El núcleo está rodeado por una monocapa de fosfolípidos que interactúa con las proteínas como enzimas implicadas en la síntesis de lípidos neutros, como el diacilglicerol acil-transferasa, carboxylase del acetilo-CoA y acil-CoA sintasa1perilipin. Debido a su comportamiento dinámico, la monocapa de fosfolípidos también contiene triacilglicerol lipasas que hidrolizan etiquetas y SE2. Dependiendo del tipo de célula y organismo, almacenados lípidos neutros pueden utilizarse para generar energía y sintetizan fosfolípidos y moléculas de señalización. En levaduras y otros hongos, el contenido de LDs cambia en respuesta a variaciones en la relación nitrógeno/carbono en los medios de cultivo, lo que indica que la disponibilidad de nitrógeno disminuida podría ser la clave para aumentar la producción de lípidos neutros3,4 ,5. La producción de grandes cantidades de etiquetas en la levadura tiene un uso potencial en la biotecnología como fuente de biocombustibles y en la industria alimentaria. Algunos lípidos almacenados contienen altas proporciones de ácidos grasos poli-insaturados, como omega 3 y omega 6, con importancia nutricional y dietética 6,7,8,9,10 , 11. LDs de células de mamíferos, incluyendo células humanas, también contienen etiquetas y ésteres de colesterol. La monocapa de fosfolípidos interacciona con los mamíferos homólogos de las proteínas se describe en la levadura Sud y con una proteína adicional, perilipin, que está ausente en S. cerevisiae12. Uno propuso el papel de la monocapa de fosfolípidos y las proteínas asociadas es estabilizar la estructura del LDs y permitir la interacción de LDs con organelos como mitocondrias, retículo endoplasmático, peroxisomas y vacuolas, principalmente para el intercambio de lípidos 13,14. Curiosamente, en los seres humanos, LDs parecen intervenir en patologías como diabetes tipo 2, ateroesclerosis, esteatohepatitis, enfermedad coronaria, en el cual hay un aumento en su número 15,16,17 . Algunos tipos de virus utilizan LDs como plataformas para ensamblar los viriones 2,18,19.

Debido a las implicaciones de la Sud en patologías humanas y su potencial uso biotecnológico, la exacta determinación experimental de formación mormona es una tarea importante. Este artículo describe un ensayo confiable basado en la recuperación de la fluorescencia (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 1-difluoro-4, 3, 5, 7, 8-r:-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), para obtener un valor relativo del contenido de lípidos neutros en las células. Con este análisis, es posible seguir la dinámica de la acumulación de lípidos neutros en hongos como U. maydis y S. cerevisiaey también en células de mamífero, sin necesidad de extracción de lípidos 20. El método fue aplicado por primera vez en S. cerevisiae para identificar las proteína fosfatasas y quinasas implicadas en la regulación del metabolismo de los lípidos. Esto fue posible sin la extracción o purificación de la proteína21,22. LFR también se ha utilizado para establecer la dinámica de formación de LDs en macrófagos peritoneales23. El uso de BODIPY 493/503 tiene algunas ventajas sobre otros tintes de lípido neutral como Nilo rojo. BODIPY 493/503 es altamente específico de lípidos neutros y tiene un espectro de emisión estrecho, facilitando la detección simultánea de señales de tintes como proteína fluorescente roja o Mito-tracker, cuando las muestras son analizadas por microscopia confocal. Por desgracia, BODIPY 493/503 es sensible al fotoblanqueo, pero este proceso puede evitarse mediante el uso de un reactivo de antiquenching durante la exposición a luz24.

Para llevar a cabo el ensayo LFR en células de levadura, son cultivadas en las condiciones nutricionales deseadas y alícuotas son retiradas en diferentes momentos. A continuación, las células son fijadas con formaldehído, que preserva la integridad de LDs para meses cuando las células son almacenadas a 4 ° C. Otras técnicas de fijación deben evitarse, sobretodo las de metanol o acetona frío, puesto que conducen a la degradación de mormones dentro de las células24. Para medir el índice de LD, formaldehído-fija las células se suspenden en agua para obtener una concentración definida. Luego, se añaden a una solución que contiene el fluoróforo BODIPY 493/503 apagada por KI, y cuando el fluoróforo entra en la célula y se asocia con la mormona, hay una recuperación de su fluorescencia. Concomitante a la medida de la fluorescencia (485 nm/510 nm), la concentración de células se cuantifica midiendo la densidad óptica a 600 nm. Cada muestra se lee cuatro veces añadiendo subsecuentes partes alícuotas de 5 μl de una suspensión celular de formaldehído-fija al mismo bien. Espacios en blanco de fluorescencia y absorbancia son adquiridos antes de la adición de las células. La calidad de los datos de absorbancia y la fluorescencia son evaluados mediante la determinación de la linealidad de las mediciones: si r < 0.9, los datos se descartan. El valor de r es importante porque básicamente la intensidad de la fluorescencia debe producir una respuesta lineal a las concentraciones de células cada vez mayor. Si la concentración de células es demasiado alta, la linealidad se pierde. El ensayo LFR proporciona un método rápido, sencillo y económico para seleccionar el fenotipo deseado de LD en experimentos de alto rendimiento. Después de seleccionar las condiciones deseadas, el contenido de LD de células individuales puede ser estudiado mediante microscopía confocal, usando el mismo formaldehído-fija las células teñidas con BODIPY, proporcionando una imagen de LDs en la célula. Sus etiquetas y el contenido SE pueden ahora más analizadas por cromatografía en capa fina.

Protocol

1. preparación de Buffers y soluciones Para preparar 1 L de fosfato tampón salino (PBS, pH 7), disolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 en 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 con ácido clorhídrico y luego añadir agua para un volumen final de 1 L. PBS puede ser hecho como un 10 x solución y almacenado a temperatura ambiente. Para preparar 10 mL de solución de fijación, añadir 1 mL de formaldehído al 37% para …

Representative Results

LFR, con BODIPY 493/503 como la punta de prueba fluorescente es un método fácil y confiable para estudiar la acumulación dinámica de LDs en U. maydis, independientemente de las condiciones de crecimiento. Cuando las células fueron cultivadas en medio YPD, hubo un aumento en el índice de LD durante la fase exponencial, seguido por un descenso en la fase estacionaria (figura 2A). En cambio, en las células cultivadas bajo hambre de nitrógeno, hu…

Discussion

LFR es un novedoso método que se aplicó por primera vez estudiar el metabolismo de los lípidos en S. cerevisiae y más tarde fue exitosamente implementado en U. maydis20,21. Aunque el índice de LD no da un valor absoluto de las etiquetas que se acumula en las células, proporciona una idea rápida del contenido en lípidos de las células, y la interpretación de los datos es sencilla cuando se comparan el índice de LD de dos o más condici…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por becas de Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (SIP-IPN-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM) y Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP y 256520 GGS). Fundação de Amparo a Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ Cientistas Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Nosotros gracias a la QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo para el Resumen esquemático. Agradecemos la valiosa ayuda de la microscopía confocal de LDs Dr. Miguel Tapia Rodríguez. Deseamos agradecer a Dr. Bruno Bozaquel Morais por su trabajo pionero en el desarrollo de la técnica en S. cerevisiae que adaptamos para U. maydis.

Materials

Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar  Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat’atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R., King, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. , 575-595 (1974).

Play Video

Cite This Article
Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

View Video