곰 팡이 병원 체 Ustilago Maydis 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정

Summary

여기, 우리가 셀 높은 처리량 실험에서 경작된에 triacylglycerols의 역학을 공부 하는 지질 작은 물방울 인덱스 (LD)를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. LD 인덱스 분석 결과 BODIPY 493/503을 사용 하는 쉽고 안정적인 방법입니다. 이 분석 결과 dispendious 지질 추출 또는 현미경 분석 필요 하지 않습니다.

Abstract

문서는 triacylglycerols (태그) 지질 작은 물방울 (LDs)에서 축적을 결정 하는 민감한 microplate 분석 결과 LD 인덱스 분석 결과 구현 하는 방법을 보여 줍니다. LD 인덱스 지질 추출 없이 얻은 것입니다. 그것은 풍부한 성장 또는 질소 고갈 미디어와 같은 다른 조건 하에서 높은 처리량 실험에서 LDs 콘텐츠 측정 있습니다. 메서드가 Saccharomyces cerevisiae 에 지질 작은 물방울 대사 연구를 처음으로 기술 되었다 쓰 신 담 Ustilago maydis에 성공적으로 적용 되었다. 흥미롭게도, LDs 세포 진 핵 세포에 phylogenetically 보존 하기 때문에 메서드를 적용할 수 있는 셀의 큰 다양성에 누 룩을 포유류 세포에서. LD 인덱스 기반 액체 형광 복구 분석 결과 (LFR)의 BODIPY 493/503 냉각 조건 하에서 포 름 알 데히드_. 고정 셀의 추가 의해 칼륨 요오드 형광 끄는로 사용 됩니다. 형광 및 광학 밀도 슬로프 사이 비율 LD 인덱스를 이름입니다. 사면 때 얻은 직선에서 계산 됩니다 BODIPY 형광 및 광학 밀도 600 nm (OD₆₀₀) 샘플 추가 대해 그려집니다. 최적의 데이터 품질 0.9 (r ≥ 0.9) 이상 동일한 상관 관계 계수에 의해 반영 된다. 미 판에서 구현 될 수 있습니다 여러 샘플을 동시에 읽을 수 있습니다. 이므로 BODIPY 493/503 닥터지 형광 염색 그 파티션을 지질 작은 물방울으로, 많은 유형의 LDs 누적 셀에 사용할 수 있습니다.

Introduction

지질 작은 물방울 (LDs)는 중성 지질, 주로 태그와 sterol 에스테 르 (SE)의 핵심의 구성 하는 유비 쿼터 스 세포내 지방 시체. 핵심은 perilipin diacylglycerol acyl-전이 효소, 아 세 틸 coa carboxylase acyl CoA synthase¹등 중립 지질 합성에 관련 된 효소 같은 단백질 상호 작용 하는 인지질 단층에 의해 둘러싸여 있습니다. 인지질 단층에는 그것의 동적 행동 때문은 태그와 SE²triacylglycerol lipases를 또한 포함 되어 있습니다. 셀 유형 및 유기 체에 따라 저장 된 중성 지질 에너지를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다 또는 합성 인지질 및 신호 분자. 효 모와 다른 균 류, LDs의 콘텐츠 변화 감소 질소 가용성 증가 중립 지질 생산^{3,4 키 수 있습니다 나타내는 배양에 질소/탄소 비율에 대 한 응답 변경 ,5}. 효 모에 태그의 높은 금액의 생산에 생명 공학의 잠재적인 사용을 사용 하 여 식품 산업 및 바이오 연료의 소스로 합니다. 오메가 3와 오메가 6, 영양과 식이 중요성 ^6,7,8,,910 와 같은 고도 불포화 지방산의 높은 비율을 포함 하는 일부 저장 된 지질 ^{, 11}. 인간 세포를 포함 한 포유류 세포의 LDs 태그와 콜레스테롤 에스테 르를 포함. LDs, 효 모에 설명 된 단백질의 동종 포유류와 추가 단백질, 결 석 perilipin 인지질 단층 작용 하는 S. cerevisiae¹². 하나 제안 인지질 단층 및 그 관련 된 단백질에 대 한 역할은 LDs 구조를 안정화 하 고 미토 콘 드리 아, 바인딩과 그물, peroxisomes, 및 그들, 주로 지질 exchange ^{에 대 한 세포와 LDs의 상호 작용 13,14}. 흥미롭게도, 인간에서 LDs 것 처럼 타입 2 당뇨병, 동맥 경화, steatohepatitis, 그리고는 그들의 번호 ^{15,16,17 증가 관상 동맥 심장 질환 같은 병 리에 관여} . 일부 유형의 바이러스 플랫폼으로 LDs를 사용 하 여 조립 virions ^2,,1819.

때문에 인간의 병 리 및 그들의 잠재적인 바이오 사용에 LDs의 의미, LDs 형성의 정확한 실험 결정 중요 한 작업입니다. 이 문서에서는 신뢰할 수 있는 분석 결과 형광 (LFR) BODIPY 493/503의 회복에 따라 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-보라-3a, 4a-diaza-s-indacene), 셀에 중립 지질 콘텐츠의 상대적 가치를 얻으려면. 이 분석 결과, 그것은 미국 maydis 와 S. cerevisiae, 같은 균 류와 포유류 세포, 지질 추출 ²⁰. 의 필요 없이 중립 지질 축적의 역학에 따라 가능 방법은 단백질 가수분해를 식별 하기 위해 S. cerevisiae 에 처음으로 적용 된 및 kinases 지질 물질 대사의 규칙. 이것은 지질 추출 또는 단백질 정화^21,22없이 가능 했다. LFR 또한 복 막 대 식 세포²³에 LDs 형성의 역학을 설정할 사용 되었습니다. 사용 BODIPY 493/503의 나 일 빨강으로 다른 중립 지질 염료 몇 가지 이점이 있다. BODIPY 493/503 중립 지질에 대 한 매우 구체적인 이며 좁은 방출 스펙트럼, confocal 현미경 검사 법에 의해 샘플을 분석할 때 붉은 형광 단백질 또는 미토-추적기 같은 염료에서 신호의 동시 탐지를 촉진 합니다. 불행 하 게도, BODIPY 493/503 photobleaching에 민감 하지만 빛²⁴노출 시 antiquenching 시 약을 사용 하 여이 프로세스를 피할 수 있다.

효 모 세포에서 LFR 시험을 수행 하기 그들은 원하는 영양 조건 하에서 경작 하 고 aliquots는 서로 다른 시간에 철회 된다. 다음으로, 셀 포 름 알 데히드, 4 ° c.에 세포는 저장 하는 때 달 동안 LDs의 무결성을 보존 고정 됩니다. 다른 고정 기법 피해 야 한다, 특히 그 이후 그들은 셀²⁴내 LDs의 저하로 이어질 찬 아세톤 또는 메탄올을 사용 하 여. LD 색인을 측정 하기 위해 포름알데히드 고정 셀 정의 농도를 물에 중단 된다. 그리고, fluorophore BODIPY 493/503 기에 의해 침묵을 포함 하는 솔루션에 추가 되는 fluorophore 셀 들어가고 Ld와 때 그것의 형광의 복구는. 형광 측정 (485 nm/510 nm)에 수 반하는, 셀의 농도 600에서 광학 밀도 측정 하 여 정량 nm. 각 샘플 잘 같은 포름알데히드-고정 셀 서 스 펜 션의 후속 5 µ L aliquots를 추가 하 여 4 번 읽습니다. 형광 및 흡 광도의 공백 셀의 추가 하기 전에 획득 됩니다. 형광의 흡 광도 데이터 품질 측정의 선형성을 확인 하 여 평가: 만약 r < 0.9, 데이터는 삭제 됩니다. R 값은 기본적으로 형광의 강도 증가 셀 농도에 선형 응답을 생성 해야 하기 때문에 중요 하다. 세포 농도가 너무 높은 경우에, 선형 손실 됩니다. LFR 분석 결과 높은 처리량 실험에서 원하는 LD 표현 형을 선택 하려면 빠르고, 간단 하 고 경제적인 방법을 제공 한다. 원하는 조건을 선택한 후 개별 셀의 LD 콘텐츠 같은 포름알데히드-고정 셀 셀에서 Ld의 이미지를 제공 하는 BODIPY와 스테인드를 사용 하 여 하는 confocal 현미경 검사 법에 의해 공부 될 수 있다. 그들의 태그와 SE 콘텐츠 수 이제 더 분석 얇은 층 크로마토그래피에 의해.

Protocol

1입니다. 버퍼 솔루션의 준비 인산 염의 1 리터를 준비 하려면 식 염 수 (PBS, pH 7) 버퍼링, NaCl, KCl, 0.2 g Na2HPO4, KH2포4 distillated 물 800 ml에서의 0.24 g 1.44 g 8 g을 분해. HCl와 7.0에 pH를 조정 하 고 추가 물 1 L. PBS의 마지막 볼륨에 대 한 재고 솔루션 x 10로 만든 고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 담합 솔루션의 10 mL를 준비 하려면 3.7%의 최종 농도 도달 하는 …

Representative Results

LFR, BODIPY와 493 일부/503 형광 프로브로 공부 미국 maydis, 관계 없이에 LDs의 동적 축적 성장 조건에 안정적이 고 쉬운 방법입니다. 셀 YPD 매체에 경작 되었다 때 증가 LD 인덱스 지 수 단계 뒤에 고정 단계 (그림 2A)에서 감소 했다. 반면, 질소 기아에서 성장 하는 셀에 모두 지 수 및 고정 단계에서 (그림 2B) LD 인덱스에 꾸준히 ?…

Discussion

LFR은 성공적으로 했다 지질 대사 S. cerevisiae 에서 공부를 처음으로 적용 된 새로운 방법 미국 maydis^20,21에서 구현. LD 인덱스 태그 셀에 축적의 절대 값에 영향을 주지 않는다, 비록 세포의 지질 콘텐츠의 빠른 생각을 LD 인덱스 두 개 이상의 실험 조건에서 비교 했을 때 데이터의 해석은 간단. BODIPY 493/503 중립 지질, 민 변의 주요 구성 요소에 ?…

Materials

Spectrophotometer	Varioskan Lux multimode microplate reade	D5879	Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar	Corning Inc.	3615	96 well black-wall/clear bottom
Plate costar	Corning Inc	3598	96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503	Invitrogen/ Thermofisher	D3922	4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution	Sigma Aldrich	252549	ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide	Sigma Aldrich	60399	BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis	ATCC	201384	Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride	Sigma Aldrich	746398	ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	ACS reagent
Select Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y100	Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus	Sigma aldrich	N4642	Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose	Sigma Aldrich	G-8270	D (+) glucose
Skaker flask	Pirex	CLS4450250-6EA	Borosiicate glass
Shaker	SEV México	INO650V-7	Orbital shaker
Centrifuge table	Eppendorf	5415C	Centrifuge
Microtubes	Sigma Aldrich	Z606340	Eppendorf
Pipet tips	Axygen scientific	T-200-Y	Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette	Biohit	725130	8 channels, volume range 5-100 uL