הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנת מועשר בתאי המשמר stomatal שימושי עבור מחקרים ביולוגיים פיזיולוגיים ואחרים.
Abstract
המחקר של תאי המשמר חיוני הידע של תרומות ספציפיות מסוג זה תא לתפקוד הכללי של צמחים. עם זאת, לעתים קרובות קשה לבודד, וכך לומד אותם לעתים קרובות מספק אתגר.
מחקר זה יוצר שיטת העשרה תא המשמר stomatal. הפרוטוקול מנצל דבק בידוד תאי המשמר ולחלץ חלבונים מהתאים. שיטה זו משפרת את תקינות ואת התשואה של משמר תא במהלך בידוד ומספק מדגם אמין לחקר תהליכי איתות התא, איך הם תשבחות פנוטיפים התנועה stomatal. בשיטה זו, העלים צמח למחיצות בין שני חלקים של הקלטת, קלוף לחתיכות כדי להסיר את הצד abaxial. פרוטוקול זה הוחל על רקמת העלה תודרנית בידוד תאי המשמר. התאים טופלו עם fluorescein diacetate (FDA) כדי לקבוע את יכולת הקיום ועם חומצה אבציסית (ABA) כדי להעריך את הפיוניות התנועה בתגובה ABA. לסיכום, פרוטוקול זה מוכיח שימושי עבור הכנת תאי המשמר stomatal מועשר ובידוד חלבונים. איכות תאים וחלבונים מתקבל כאן אפשר פיזיולוגיים, מחקרים ביולוגיים אחרים.
Introduction
הפיוניות יש תפקיד חשוב ב פיזיולוגיה והכושר הכללי של צמחים. מבנים ספציפיים אלה צמח זעיר נוצרות על ידי שני תאים באפידרמיס מיוחדים המכונה תאי המשמר, מצויים בשפע ביותר על פני השטח abaxial של עלים. הפיוניות נחוצים לצורך עסקת חילופי גזים בין הצמח, האווירה, כמו גם השליטה של אובדן מים באמצעות דיות. תאי המשמר לווסת את הפיוניות צמצם באמצעות שילוב בין חיצוניים שונים (למשל, אור, לחות, קשר הפתוגן, רמות פחמן דו-חמצני) ופנימיים (למשל., הורמונים אנדוגניים) גירויים1,2. ב-20 השנים האחרונות, סוג התא הזה הפך מערכת מודל עבור תא לומד איתות תהליכים במפעלים. תאים אלה מהווים חלק קטן של התאים הכולל עלה; לפיכך, לחקור שלהם סלולרי ייחודי, מאפייני הביוכימי והמולקולרי בצורה מתא בודד, יש צורך לבודד אותם מכל סוגי תאים אחרים עלה. בעבר, מחקרים משמר תא יש לעיתים קרובות מעורבים הכנת משמר תא protoplasts (GCP)3,4,5. זה בדרך כלל דורשת השימוש בכמויות גדולות של דופן התא משפילים אנזימים ו/או שיבושים מכניים באמצעות מיזוג, הוכיחה להיות יקר וארוך כמו בדרך כלל זה לוקח שעות רבות כדי להכין מדגם GCP, לעתים קרובות פעמים עם תשואה קטנה. וחשוב מכך, כי תאי המשמר לשמש מלאה זוגות כדי לווסת את הפיוניות הצמצם, ניתן לראות את השימוש GCP כמערכת מלאכותי ללמוד איתות התא משמר.
. הנה, פיתחנו שיטה להכין הפיוניות בו תאי המשמר שלם מועשרים, לשמור על תגובות פיזיולוגיות לגירויים. שיטה זו בהשראת שיטה שבה השתמשת כדי לבודד mesophyll תא protoplasts6,7. בשיטה שלנו, הפיוניות מוכנות תוך שימוש ברור דבק להפריד תחילה את רוב התאים mesophyll מחובר השכבה adaxial של העלה מהשכבה abaxial המכילות את המדרכה ואת משמר תאים. פעולה זו מתבצעת על ידי הדבקות נייר-דבק לשני הצדדים של העלה פילינג אותם בנפרד. התאים מהשכבה abaxial מותר לשחזר תחת אור במאגר פתיחת הפיוניות. מאוחר יותר תאים המדרכה מוסרות באמצעות כמות קטנה של דופן התא משפילים אנזימים, משאיר מאחורי תא משמר כי הם מועשרים בקלטת.
בשיטה זו פשוטה, התאים משמר stomatal כי הן קיימא מגיב יכולים במהירות, ביעילות תהיה מוכן, לוקח פחות משעה להשיג מועשר בתאי המשמר stomatal מקליפות 50 בעלות מינימלית. השיטה כאן מטיל פחות נזק לתאי הצמח מאשר שיטות קודמות איפה protoplasts מוכנים. בנוסף, החומרים נאספו מ כמויות חלבון רצויה זו שיטת התשואה. והכי חשוב, כי העלה שלא עובר מיזוג או עיכול ממושך פעמים ותאים משמר נותרו ללא פגע, תוצאות ללמודי הדוק יותר יהיו רלוונטיים לזה של הביולוגיה של התא משמר טבעי. בשיטה זו, תנועות stomatal ישויך בזמן אמת עם שינויים ברמה המולקולרית. לפיכך, הידע שנרכש ממחקרים בשיטה זו הכנה יהיה חשוב להבנה מקיפה יותר של איתות התא משמר.
השתמשנו הצמח תודרנית לבנה כמודל; אולם פרוטוקול זה ניתן ליישם את העשרת של stomatal תאי המשמר מינים אחרים כגון כרוב napus עם שינויים קטנים בזמן העיכול. מהווה הוכחה של המושג, הראו כי תאי המשמר stomatal מועשר באמצעות שיטה זו הם קיימא מגיב לגירויים כפי שמוצג על ידי fluorescein diacetate (FDA) assay לימודי ניצול של חומצה אבציסית הורמון צמחי (ABA), בהתאמה. בנוסף, הראו כי חלבונים באיכות גבוהה יכול להיות מבודד תאים אלה משמר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט של תהליך זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
משמר תאים הם מערכת מודל לימוד האות מנגנוני התמרה חושית בצמחים וזה חשוב לוודא כי הכנת דוגמאות השתמשו במחקר הוא המתאים ביותר כדי לענות על שאלות ביולוגיות. למרות העניין הגובר והולך משמר תאים בתוך קהילת המחקר צמח, יש אין שיטה אוניברסלית באיך להכין stomatal תאי המשמר שיאפשר תנועה stomatal והן פיזיולוג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים דניאל חן מ דיגיטלית וידאו הפקה צוות של בוכהולץ מהתיכון. סיוע בעריכת הוידאו. מחקר זה על תאי המשמר stomatal, פרוטאומיקס, גליקומיקס במעבדה חן היא נתמכה על ידי מענקים אותנו הקרן הלאומית למדע (0818051, 1158000 ו- 1412547). קונג Wenwen נתמך על ידי המועצה מלגה סין. ד ר Qiuying פאנג נתמך על ידי סין מלגת מועצה נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31570396).
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
