الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس
Summary
هذا البروتوكول وصف أسلوب إعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب مفيد للدراسات البيولوجية الفسيولوجية وغيرها.
Abstract
دراسة خلايا الحرس ضروري لمعرفة المساهمات المحددة لهذا النوع من الخلية للدالة الشاملة للنباتات. ومع ذلك، غالباً ما يصعب عزل وهكذا دراستها غالباً ما يوفر تحديا.
تحدد هذه الدراسة أسلوب إثراء stomatal حارس خلية. ويستخدم البروتوكول اﻻسكتلندي لعزل خلايا الحرس واستخراج البروتينات من الخلايا. هذا الأسلوب يحسن السلامة والعائد لحراسة الخلية أثناء العزل وتوفر نموذج موثوق بها لدراسة عمليات إرسال الإشارات في الخلية، وكيفية الربط بين حركة ستوماتال تعمل. في هذا الأسلوب، أوراق النبات تم تقسيمه بين جزأين من الشريط ومقشرة بعيداً لإزالة الجانب أباكسيال. تم تطبيق هذا البروتوكول على أنسجة أوراق نبات لعزل خلايا الحرس. الخلايا تعامل مع فلوريسسين اسيتات (FDA) لتحديد جدوى وحمض التسقيط (ABA) لتقييم حركة الثغور في الاستجابة لرابطة المحامين الأمريكية. وفي الختام، يثبت هذا البروتوكول مفيدة لإعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب وعزل البروتينات. الحصول على نوعية الخلايا والبروتينات هنا تمكين الفسيولوجية والدراسات البيولوجية الأخرى.
Introduction
الثغور دوراً هاما في علم وظائف الأعضاء واللياقة البدنية للنباتات عموما. هذه الهياكل محطة صغيرة محددة يتم تشكيلها من قبل اثنين من خلايا البشرة المتخصصة المعروفة باسم خلايا الحرس وتم العثور على الأكثر وفرة على سطح الأوراق أباكسيال. الثغور ضرورية لتبادل الغازات بين النبات والغلاف الجوي، فضلا عن السيطرة على فقدان الماء عن طريق النتح. تنظيم خلايا الحرس الفتحة الثغور من خلال التكامل الخارجي مختلفة (مثلاً، والضوء، والرطوبة، والممرض الاتصال، مستويات ثاني أكسيد الكربون) والداخلية (على سبيل المثال.، الهرمونات الذاتية) المحفزات1،2. في السنوات العشرين الماضية، أصبح هذا النوع خلية نظام نموذجي لدراسة الخلية إشارات العمليات في مصانع. هذه الخلايا تشكل نسبة ضئيلة من مجموع الخلايا في ورقة؛ وهكذا، للتحقيق على الخلوي فريدة من نوعها، الخصائص الكيميائية الحيوية والجزيئية في طريقة وحيدة الخلية، ومن الضروري أن عزلها عن سائر أنواع خلية ورقة. في الماضي، كثيرا ما شملت الدراسات خلية الحرس إعداد خلية الحرس بروتوبلاستس (GCP)3،،من45. هذا عادة يتطلب استخدام كميات كبيرة من الإنزيمات المهينة جدار الخلية واو تعطل الميكانيكية عن طريق مزج، وقد ثبت أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لأنه يأخذ عادة عدة ساعات لإعداد عينة GCP، كثيرا ما مرات مع العائد القليل. الأهم من ذلك، لأنه بمثابة خلايا الحرس أزواج كاملة لتنظيم الفتحة الثغور، استخدام GCP يمكن اعتبار نظام مصطنع لدراسة مما يشير إلى خلية الحرس.
هنا، قمنا بتطوير أسلوب إعداد الثغور التي هي إثراء سليمة الحرس الخلايا والحفاظ على الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات. هذه الطريقة مستوحاة من أسلوب الذي تم استخدامه لعزل mesophyll خلية بروتوبلاستس6،7. في أسلوبنا، تعد الثغور باستخدام واضحة اﻻسكتلندي لأول مرة فصل غالبية الخلايا mesophyll يعلق على طبقة أداكسيال نبات من طبقة أباكسيال التي تحتوي على خلايا الحرس والرصيف. يتم ذلك عن طريق لصق قطعة من الشريط لكل جانب من النبات وتقشير لهم عن بعضها البعض. الخلايا من طبقة أباكسيال يسمح باسترداد تحت الضوء في المخزن مؤقت فتح الثغور. بعد تتم إزالة الخلايا الأرصفة المتبقية باستخدام كمية صغيرة من جدار الخلية اللاإنسانية الإنزيمات، تاركة وراءها الحرس الخلية التي يتم إثراء على الشريط.
في هذه الطريقة البسيطة، خلايا الحرس ستوماتال تكون قابلة للاستمرار وتستجيب بسرعة وكفاءة تكون مستعدة، مع أخذ أقل من ساعة واحدة للحصول على خلايا الحرس ستوماتال المخصب من القشور 50 مع أدنى حد من التكلفة. الأسلوب هنا يفرض أقل ضررا على الخلايا النباتية من الأساليب السابقة حيث يتم إعداد بروتوبلاستس. وباﻹضافة إلى ذلك، المواد التي جمعت من هذا الأسلوب الغلة البروتين المرغوب فيه المبالغ. الأهم من ذلك، لأن الورقة لا تخضع لمزج أو خلايا الحرس وأوقات الهضم طويلة تبقى على حالها، ونتائج الدراسات سوف أوثق تكون ذات الصلة بعلم الأحياء الطبيعية خلية الحرس. مع هذا الأسلوب، يمكن الربط بين حركات stomatal في الوقت الحقيقي مع التغيرات على المستوى الجزيئي. وبالتالي، سيكون من المهم إلى فهم أكثر شمولاً لخلية الحرس مما يشير إلى المعرفة المكتسبة من استخدام هذا الأسلوب في إعداد الدراسات.
كنا النبات نبات التمويل كنموذج؛ ومع ذلك يمكن تطبيق هذا البروتوكول في إثراء stomatal خلايا الحرس في الأنواع النباتية الأخرى مثل نابوس كرنب مع بعض التعديلات الصغيرة في وقت الهضم. كدليل على المفهوم، لقد أظهرنا أن خلايا الحرس ستوماتال المخصب عن طريق هذا الأسلوب ناجعة وسريعة الاستجابة للمحفزات كما هو موضح بمقايسة اسيتات (FDA) fluorescein ودراسات استخدام حمض التسقيط هرمون النبات (ABA)، على التوالي. وباﻹضافة إلى ذلك، أثبتنا أن البروتينات عالية الجودة يمكن أن تكون معزولة من هذه الخلايا الحرس. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل لهذه العملية.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلايا الحرس نظام نموذجي لدراسة آليات توصيل الإشارات في النباتات ومن المهم التأكد من أن إعداد العينات المستخدمة في هذه الدراسة هو الأكثر ملاءمة للإجابة على الأسئلة البيولوجية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بخلايا الحرس داخل مجتمع البحوث النباتية، هناك لا يوجد طريقة عالمية على كيفية إع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر دانيال تشن من “الرقمية الفيديو إنتاج فريق من بوشهولز المدرسة الثانوية” للمساعدة في تحرير الفيديو. دعمت هذه البحوث stomatal الحرس الخلايا والبروتينات وجميع في مختبر تشن من المنح المقدمة من “لنا المؤسسة الوطنية للعلوم” (0818051 و 1158000 و 1412547). ويدعم “مجلس المنح الدراسية الصيني” كونغ فنون. الدكتور قيوينج بانغ معتمد من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31570396).
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
