Fita de estomas-casca: Um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda
Summary
Este protocolo descreve um método de preparação estomáticas enriquecidas guarda células que é útil para estudos biológicos fisiológicos e outros.
Abstract
O estudo das células guarda é essencial para o conhecimento das contribuições específicas deste tipo de célula para a função global de plantas. No entanto, muitas vezes é difícil isolar e, portanto, estudá-los muitas vezes fornece um desafio.
Este estudo estabelece um método de enriquecimento de célula estomática de guarda. O protocolo utiliza fita adesiva para isolar as células guarda e extrair as proteínas das células. Esse método melhora a integridade e o rendimento da célula guarda durante o isolamento e fornece uma amostra confiável para o estudo dos processos de sinalização celular e como eles se correlacionam com fenótipos movimento estomático. Neste método, as folhas da planta foram particionadas entre duas partes da fita e pedaços descascadas para remover o lado abaxial. Este protocolo foi aplicado ao tecido de folha de Arabidopsis para isolar as células guarda. As células foram tratadas com diacetato de fluoresceína (FDA) para determinar a viabilidade e com ácido abscísico (ABA) para avaliar o movimento de estômatos em resposta a ABA. Em conclusão, este protocolo prova útil para preparar células de guarda estomáticas enriquecidas e isolar proteínas. A qualidade das células e proteínas obtidas aqui enable fisiológico e outros estudos biológicos.
Introduction
Estomas desempenham um papel importante na fisiologia geral e adequação das plantas. Estas estruturas específicas de pequena planta são formadas por duas células epidérmicas especializadas conhecidas como células de guarda e são encontradas mais abundantemente na superfície abaxial das folhas. Estomas são necessárias para a troca de gases entre a planta e a atmosfera, bem como o controle da perda de água através da transpiração. Guarda as células regulam a abertura de estômatos, através da integração de diferente externa (por exemplo, luz, umidade, contato do patógeno, os níveis de dióxido de carbono) e interna (ex., hormônios endógenos) estímulos1,2. Nos últimos 20 anos, este tipo de célula tornou-se um modelo de sistema para sinalização de processos em plantas de celular estudando. Essas células compõem uma pequena fração das células totais em uma folha; assim, para investigar seu celular exclusivo, propriedades bioquímicas e moleculares de uma célula única forma, é necessário isolá-los de outros tipos de células da folha. No passado, estudos de célula guarda muitas vezes envolveram a preparação da célula guarda protoplastas (GCP)3,4,5. Isto normalmente requer o uso de grandes quantidades de enzimas degradantes de parede celular e/ou ruptura mecânica através de mistura e tem provado ser dispendioso e demorado, que geralmente leva muitas horas para preparar uma amostra GCP, muitas vezes vezes com pouco rendimento. Mais importante, porque as células guarda atuar como pares completas para regular a abertura de estômatos, o uso do GCP pode ser visto como um sistema artificial para estudar a sinalização da pilha de guarda.
Aqui, nós desenvolvemos um método para preparar estomas na qual células intactas de guarda são enriquecidas e manter respostas fisiológicas aos estímulos. Este método foi inspirado por um método que foi usado para isolar o mesofilo célula protoplastas6,7. Em nosso método, estomas são preparadas com clara de fita adesiva para separar primeiro a maioria das células do mesofilo anexado à camada adaxial da folha da camada abaxial contendo o pavimento e as células de guarda. Isso é feito pela aposição de um pedaço de fita para cada lado da folha e descascá-las separadas. As células da camada abaxial podem recuperar sob a luz em um buffer de estomas-abertura. Mais tarde, as células restantes do pavimento são removidas usando uma pequena quantidade de parede celular degradante enzimas, deixando para trás células guarda que são enriquecidos na fita.
Neste método simples, estomáticas células guarda que sejam viáveis e responsivo pode rapidamente e eficientemente ser preparado, tendo menos de uma hora para obter células de guarda estomáticas enriquecidas de 50 cascas com um custo mínimo. O método aqui impõe menos danos às células da planta do que métodos anteriores, onde os protoplastas são preparados. Além disso, materiais colhidos este quantidades de proteína desejável de rendimento de método. O mais importante, porque a folha não está sujeita a mistura ou tempos de digestão demorada e guarda as células permanecem intactas, os resultados dos estudos mais estreita será relevantes para que um guarda do natural da biologia das células. Com este método, estomáticas movimentos possam ser correlacionados em tempo real com as mudanças a nível molecular. Assim, o conhecimento adquirido com estudos usando esse método de preparação seria importante para uma compreensão mais abrangente da sinalização celular de guarda.
Usamos a planta Arabidopsis thaliana como modelo; no entanto, este protocolo pode ser aplicado para o enriquecimento das células de guarda estomáticas em outras espécies de plantas tais como Brassica napus com pequenas modificações no tempo de digestão. Como uma prova de conceito, temos demonstrado que células de guarda estomáticas enriquecidas através deste método são viáveis e responsivo a estímulos como mostrado pelo ensaio de fluoresceína diacetato (FDA) e estudos utilizando hormônio vegetal ácido abscísico (ABA), respectivamente. Além disso, Nós demonstramos que proteínas de alta qualidade podem ser isoladas destas células guarda. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado desse processo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Guarda as células são um sistema de modelo para estudar os mecanismos de transdução de sinal nas plantas e é importante garantir que a preparação de amostras utilizadas no estudo é o mais adequado para responder às perguntas biológicas. Apesar do crescente interesse em células de guarda dentro da comunidade de pesquisa de planta, não existe nenhum método universal sobre como preparar estomáticas células guarda que permita o movimento estomático e fisiologia bem como as alterações moleculares para ser es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Daniel Chen na Digital vídeo produção equipe de Buchholz High School para assistência na edição do vídeo. Esta pesquisa sobre estomáticas células de guarda, proteómica e metabolómica no laboratório de Chen foi apoiada por concessões nos National Science Foundation (0818051, 1158000 e 1412547). Wenwen Kong é suportado pelo Conselho da bolsa de China. Dr. Qiuying Pang é suportado pela China Scholarship Council e Fundação Nacional de ciências naturais da China (31570396).
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
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