Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico
Summary
Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.
Abstract
La diabrotica del mais (WCR) è un parassita importante di mais ed è ben noto per la sua capacità di adattarsi rapidamente alle strategie di lotta. Anche se l’interferenza del RNA (RNAi) ha dimostrato di essere un potente strumento per lo studio della biologia WCR, ha i suoi limiti. In particolare, il RNAi sé è transitoria (cioè non provocare a lungo termine eredità mendeliana del fenotipo associato), e richiede la conoscenza della sequenza del DNA del gene target. Quest’ultimo può essere limitante se il fenotipo di interesse è controllato da geni scarsamente conservati, o anche romanzo, perché sarebbe difficile identificare gli obiettivi utili, se non impossibile. Di conseguenza, il numero di strumenti nella casella degli strumenti genomico di WCR dovrebbe essere ampliato dallo sviluppo di metodi che potrebbero essere utilizzati per creare ceppi mutanti stabile e attivare sondaggi indipendente dalla sequenza del genoma del WCR. Nel presente documento, dettagliamo i metodi utilizzati per raccogliere e microinject precellular embrioni WCR con acidi nucleici. Mentre i protocolli descritti nel presente documento sono finalizzati alla creazione di transgenici WCR, editing CRISPR/Cas9-genomico potrebbe essere eseguita anche utilizzando gli stessi protocolli, con l’unica differenza è la composizione della soluzione iniettata gli embrioni.
Introduction
Diabrotica del mais (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, è un parassita importante di mais1. È interessante notare, WCR sembra superare controllo misure più rapidamente di artropodi di interesse agrario più poiché essi non solo adattarsi fisiologicamente ma anche comportamentale2,3,4,5, 6. nell’ultimo decennio, interferenza del RNA (RNAi), un potente strumento di genomico funzionale, è stato studiato come un metodo di controllo potenziale per WCR7,8ed è stato utilizzato anche come mezzo per studiare il gene funzione9. Tuttavia, mentre RNAi è effettuato frequentemente dal microinjection di RNA double-stranded (dsRNA) in altre specie, basati su iniezione RNAi è raro in WCR. In realtà, ci sono soltanto alcuni rapporti di RNAi tramite microiniezioni di dsRNA in WCR9. Il motivo è che WCR possono raggiungere livelli elevati di gene atterramento tramite ingestione di dsRNA7,10, permettendo anche lo studio degli effetti embrionali di alimentazione dsRNA di madre11. Mentre questo metodo rende WCR un ottimo soggetto per analisi genomica funzionale tramite RNAi, ha rallentato progressi nello sviluppo di metodologie per il microinjection embrionale in questa specie.
Nonostante la potenza del RNAi, ci sono alcuni svantaggi. Ad esempio, non tutti i geni rispondono ugualmente a RNAi. Questa variabilità può rendere l’interpretazione dei risultati di un’analisi di genomica funzionale più difficile. Inoltre, RNAi è transitoria e non genera mutazioni ereditabili. D’altra parte, la trasformazione di germline, un altro strumento di genomico funzionale, può generare mutazioni ereditabili tramite inserimento di un elemento trasponibile contrassegnato nella genoma12,13. Questo rende la trasformazione di germline un ottimo strumento per la creazione di ceppi mutanti per uso a lungo termine studi genetici. Trasformazione può essere utilizzata anche per salvare una mutazione formulando una copia funzionale del gene per un genoma mutante14. Inoltre, la trasformazione di germline è la pietra angolare di un’ampia varietà di tecniche di genetica molecolare. Oltre a buttare giù e/o salvataggio di funzione del gene, germline trasformazione può essere utilizzata per enhancer intrappolamento15, gene dell’intrappolamento16, espressione ectopica basata su Gal417e genoma mutagenesi18.
Più recentemente, sono stati sviluppati strumenti che consentono la modifica del genoma sofisticato. Questi strumenti includono trascrizione Activator-Like effettrici nucleasi (TALEN) e il sistema CRISPR/Cas9-nucleasi19,20. Il vantaggio di questi nuovi strumenti è che essi offrono ai ricercatori la capacità di indurre una rottura del DNA double-stranded in quasi qualsiasi posizione all’interno di quasi qualsiasi genoma. Una volta indotta, queste rotture possono essere riparate attraverso entrambe le estremità non-omologo entrare, che possono introdurre le eliminazioni o inserimenti nel gene mirato, o riparazione di omologia-diretto, che in presenza di un costrutto ingegnerizzato, può catalizzare la sostituzione dell’intero geni o regioni genetiche21,22. Tuttavia, questi metodi richiedono la microiniezione di DNA, RNA e/o della proteina negli embrioni molto giovani.
Cosa importante, a differenza di RNAds utilizzato per RNAi, acidi nucleici e proteine utilizzate per germline trasformazione ed editing genomico non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Di conseguenza, microiniezione di plasmide DNAs, mRNA, e/o proteine deve avvenire durante la fase di blastoderm sinciziale (cioè prima che l’embrione dell’insetto cellularizes). Questo rende la tempistica delle iniezioni un fattore critico. Ad esempio, nella Drosophila melanogaster, embrioni necessario essere iniettata entro due ore dopo uovo laici12. Di conseguenza, lo sviluppo di un protocollo di successo embrionali microiniezione per WCR deve tener conto le migliori condizioni per la posa di uovo femminile, così come il metodo migliore per la raccolta di una quantità sufficiente di embrioni precellular.
Un tentativo di portare una vasta gamma di strumenti di genetica molecolare su biologia WCR richiede lo sviluppo di metodologie di raccolta ed microinjecting precellular embrioni WCR. Qui forniamo istruzioni dettagliate, insieme a suggerimenti e trucchi, per aiutare gli altri a utilizzare tecniche basate sulla trasformazione nella ricerca WCR. Oltre a estendere tecnologie transgeniche a WCR per uso negli studi di genomici funzionali, queste tecniche consentono anche potente nuove strategie di controllo dei parassiti come gene unità23,24 per essere testato in questo economicamente importante dei parassiti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se microinjection di WCR con RNAds ai fini della RNAi è stato segnalato9, questo è il primo protocollo per stabilire le migliori pratiche per microinjecting precellular embrioni WCR, un processo critico per lo svolgimento di germline trasformazione e/o CRISPR/Cas9 genoma di editing in questa specie. Successo microiniezione di embrioni WCR è dipendente da molti fattori, come l’efficienza di trasformazione. Discussi di seguito alcune delle questioni principali stanno influenzando il risulta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del programma di ricerca di Monsanto mais Diabrotica conoscenza, assegnare un numero AG/1005 (a MDL e YC) e fondi di Start-up per MDL dal NCSU. FC è stata sostenuta da sovvenzioni da parte mais Diabrotica Knowledge Research Program di Monsanto (AG/1005) e la National Science Foundation, concedere numero MCB-1244772 (MDL). Gli autori non dichiarano interessi concorrenti. FC e MDL ideato e progettato gli esperimenti; FC, PW e SP effettuati gli esperimenti; FC e MDL ha analizzato i risultati; e FC, NG e MDL ha scritto il manoscritto. Ringraziamo Teresa O’Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski per loro assistenza di esperti in selezione WCR. Ringraziamo anche il dottor Wade French (USDA-ARS, laboratorio di ricerca agricola Centrale Nord, Brookings, SD) per le spedizioni di uova di stabilire colonie di laboratorio e fornendo protocolli di allevamento.
Materials
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5×7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
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