Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과
Summary
여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.
Abstract
서양 옥수수 rootworm (WCR) 옥수수의 중요 한 해충 이며, 해충 관리 전략에 빠르게 적응 하는 능력으로 잘 알려져 있다. RNA 간섭 (RNAi) WCR 생물학 공부를 위한 강력한 도구가 될 수 입증 하고있다, 그것은 한계가 있다. 특히, RNAi 자체는 일시적 (즉 귀착되 지 않는다 관련 된 표현 형의 장기 Mendelian 상속), 그것은 대상 유전자의 DNA 순서를 알고 필요 합니다. 후자 수 수 제한 관심의 표현 형이 제대로 보존 하 고, 또는 심지어 새로운 유전자에 의해 제어 되는 경우 유용한 목표 식별 도전 될 것 이라고, 때문에 불가능. 따라서, 안정적인 돌연변이 체 긴장을 만들고 WCR 게놈의 순서에 관계 없이 조사를 활성화 하는 데 사용할 수 있는 방법의 개발에 의해 WCR의 게놈 도구 상자에서 도구 수를 확장 한다. 여기, 우리가 수집 하 고 핵 산와 precellular WCR 배아를 microinject 하는 데 사용 하는 방법 자세하게. 여기에 설명 된 프로토콜은 유전자 변형 WCR의 생성을 위한, 그러나 CRISPR/Cas9-게놈 편집 수 또한 수행 유일한 차이 배아에 주입 하는 솔루션의 구성 되 고 동일한 프로토콜을 사용 하 여.
Introduction
서 부 옥수수 rootworm (WCR) Diabrotica virgifera virgifera, 옥수수1의 중요 해충 이다. 흥미롭게도, WCR 제어를 극복 하기 위해 표시 됩니다 그들은 뿐만 아니라 적응 뿐만 아니라 순수 행동2,3,,45, 이후 가장 농업 해충 보다 더 빠르게 측정 6. 지난 10 년간, RNA 간섭 (RNAi), 강력한 기능 게놈 도구 WCR7,8에 대 한 잠재적인 제어 방법으로 조사 되 고 유전자 기능9공부 하는 수단으로도 사용 되었습니다. 그러나, RNAi 다른 종에서 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 microinjection에 의해 자주 수행 하는 동안 주입 기반 RNAi WCR에 드문 경우입니다. 사실, 몇 가지 보고서만 RNAi 통해 microinjection dsRNA의 WCR9에 있다. 이유는 심지어 어머니11dsRNA를 먹이로 미 발달 효과의 연구를 허용 하 게 되는 높은-수준의 유전자 때 려 눕 힘 을 통해 섭취 dsRNA7,10, WCR에 달성할 수 있다. 이 방법을 만드는 동안 WCR 기능 게놈 분석 통해 RNAi를 위한 우수한 주제, 그것은 배아 microinjection이 수이 종에 대 한 방법론의 개발 진행을 둔화 했다.
RNAi의 힘에도 불구 하 고 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어 모든 유전자 RNAi를 동등 하 게 응답합니다. 이 변화는 더 어려운 기능 유전체학 시험의 결과 해석 할 수 있습니다. 또한, RNAi는 일시적 이며 상속 돌연변이 생성 하지 않습니다. 다른 한편으로, 생식 변환, 다른 기능 게놈 도구, 상속 돌연변이 통해 삽입 표시 transposable element의 게놈12,13으로 생성할 수 있습니다. 이것은 생식 변환 장기 유전 연구에 사용 하기 위해 돌연변이 종자를 만들기 위한 훌륭한 도구. 변환 돌연변이 게놈14에 유전자의 기능 복사본을 제공 하 여 돌연변이 구출 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 생식 변환 다양 한 분자 유전 기법의 초석입니다. 밖으로 노크 및 유전자 기능 구조, 뿐만 아니라 생식 변환 증강 트래핑15, 유전자 트래핑16, Gal4 기반 소성 식17, 및 게놈 넓은 mutagenesis18사용할 수 있습니다.
더 최근에, 정교한 게놈 편집 사용할 수 있는 도구 개발 되었습니다. 이러한 도구에는 전사 Activator-Like 이펙터 Nucleases (TALEN) 및 CRISPR/Cas9-nuclease 시스템19,20포함 됩니다. 이러한 새로운 도구의 장점은 그들은 거의 모든 게놈 내의 거의 모든 위치에서 이중 가닥 DNA 휴식을 유도 하는 능력 연구원을 제공. 삭제 또는 타겟된 유전자에 삽입 발생할 수 있습니다, 어느 비 동종 끝, 또는 상 동 감독 수리, 설계 구축 존재 촉매 수 있습니다 통해이 나누기를 복구할 수 있습니다 유발, 일단은 전체 유전자 또는 유전 지역21,22의 교체. 그러나, 이러한 방법을 사용 하려면 아주 어린 배아로 DNA, RNA 및 단백질의 microinjection.
중요 한 것은, RNAi, 핵 산 및 단백질 생식에 대 한 사용 사용 dsRNAs 달리 변환 및 게놈 편집 교차할 수 없습니다 쉽게 세포 막. 따라서, 플라스 미드 DNAs, mRNAs, 단백질의 microinjection syncytial blastoderm 단계 (즉 곤충 태아 cellularizes 전에) 자리를 차지할 해야 합니다. 이것은 주사의 타이밍 중요 한 요소. 예를 들어 초파리 melanogaster, 배아 달걀 누워12후 2 시간 이내에 주입을 해야 합니다. 따라서, 여성 달걀 누워, precellular 배아의 충분 한 수량을 수집 하기 위한 가장 좋은 방법에 대 한 최상의 조건 WCR에 대 한 성공적인 배아 microinjection 프로토콜의 개발 계정에 취해야 합니다.
다양 한 분자 유전 도구 WCR 생물학에 대 한 부담을가지고 노력 수집 및 microinjecting precellular WCR 배아에 대 한 방법을 개발 해야 합니다. 여기 우리 WCR 연구에서 변환 기반 기술을 사용 하 여 다른 사람들을 돕고 팁과 트릭, 함께 자세한 지침을 제공 합니다. 기능적 게놈 연구에 사용 하기 위해 유전자 변형 기술을 WCR 연장, 뿐만 아니라 이러한 기술 또한 테스트할이 경제적으로 중요 한 유전자 드라이브23,24 등 강력한 새로운 해충 제어 전략 사용 해충입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
비록 dsRNAs RNAi 목적으로 WCR의 microinjection 보고9, 이것이 microinjecting precellular WCR 배아 생식 변환 수행을 위한 중요 한 과정에 대 한 우수 사례를 확립 하는 첫 번째 프로토콜 및 CRISPR/Cas9 게놈이이 종에서 편집입니다. WCR 배아의 성공적인 microinjection 변환 효율성은 여러 요소에 따라 달라 집니다. 아래는 몇 가지 주요 문제에 영향을이 프로토콜을 사용 하 여 생식 변혁이이 딱정벌레?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 몬산토 옥수수 Rootworm 지식 연구 프로그램에서 교부 금에 의해 지원 되었다, NCSU에서 MDL 번호 AG/1005 (MDL을 YC) 및 시작 자금 부여. FC 몬산토의 옥수수 Rootworm 지식 연구 프로그램 (AG/1005)와 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 부여 번호 MCB-1244772 (MDL). 저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다. FC 및 MDL 잉태와 설계 실험; FC, 비밀 번호 및 SP 수행 실험; FC 및 MDL 분석 결과; 그리고 FC, NG 및 MDL 원고를 썼다. 우리 감사 테레사 오리 어 리, 윌리엄 Klobasa, 그리고 스테파니 고르 WCR 심사에서 그들의 전문가 도움. 우리는 또한 양육 프로토콜을 제공 하 고 실험실 식민지를 설치 하는 계란의 출하에 대 한 박사 웨이드 프랑스어 (미국 농 무부-ARS, 북쪽 중앙 농업 연구소, 브루킹스, SD) 감사 합니다.
Materials
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5×7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
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