Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme
Summary
Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.
Abstract
Batı Mısır rootworm (WCR) Mısır önemli bir böcek ve haşere Yönetim Stratejileri için hızla adapte kabiliyetini için bilinen. RNA müdahale (RNAi) WCR biyoloji okuyan için güçlü bir araç olduğunu kanıtlamıştır rağmen kendi sınırlamaları vardır. Özellikle, RNAi kendisi geçici (Yani tam yol ilişkili fenotip uzun vadeli Mendel miras), ve hedef gen DNA dizisi bilerek gerektirir. Fenotip ilgi kötü korunmuş veya bile roman genler tarafından kontrol edilir eğer yararlı hedefler belirlenmesi zor olabilir çünkü ikinci imkansız olmasa sınırlama. Bu nedenle, dizi WCR’ın genomik araç kutusundaki araç istikrarlı mutant suşları oluşturmak ve WCR genom dizisi bağımsız çalışmaları etkinleştirmek için kullanılabilir yöntemleri geliştirme tarafından genişletilip. Burada, biz toplamak ve nükleik asitler ile precellular WCR embriyo microinject için kullanılan yöntemleri ayrıntılı. Burada açıklanan protokoller transgenik WCR yaratılması hedefleniyor iken, CRISPR/Cas9-genom düzenleme de embriyo enjekte çözüm bileşimi olmanın tek farkı ile aynı protokolleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Introduction
Batı Mısır rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, önemli bir böcekten Mısır1var. İlginçtir, denetim üstesinden gelmek için WCR görünür onlar sadece fizyolojik olarak aynı zamanda davranışsal2,3,4,5, uyum bu yana en Tarım zararlıları daha hızlı ölçer 6. son on yıl içinde RNA müdahale (RNAi), güçlü bir işlevsel genomik araç, WCR7,8için potansiyel bir kontrol yöntemi olarak incelenmiş ve gen fonksiyon9eğitim için bir araç olarak da kullanılmıştır. RNAi sık mikroenjeksiyon çift iplikçikli RNA (dsRNA) diğer türler tarafından gerçekleştirilir, ancak, RNAi enjeksiyon tabanlı WCR içinde nadir iken. Aslında, RNAi yolu ile mikroenjeksiyon dsRNA in WCR9içine sadece bir kaç rapor ediliyor. WCR bile annem11‘ e dsRNA besleyerek embriyonik etkileri çalışma izin dsRNA7,10, için gen devirme yolu ile yenmesi yüksek düzeyde elde edebilirsiniz nedenidir. Bu yöntem WCR fonksiyonel genomik analiz yoluyla RNAi için mükemmel bir konu yapar iken, bu türlerin embriyonik mikroenjeksiyon yöntemleri geliştirmedek ilerlemeyi yavaşladı.
RNAi güç rağmen bazı dezavantajları vardır. Örneğin, tüm genler eşit RNAi için yanıt. Bu değişkenliği daha zor bir işlevsel genomik tahlil sonuçlarını yorumlama yapabilirsiniz. Ayrıca, RNAi geçici ve kalıtsal mutasyonlar oluşturmaz. Öte yandan, germline dönüştürme, başka bir işlevsel genomik aracı, kalıtsal mutasyonlar ile işaretli olan öğesinin içine ekleme genom12,13oluşturabilirsiniz. Bu uzun vadeli genetik çalışmalarda kullanılmak mutant suşları oluşturmak için mükemmel bir araç germline dönüştürme yapar. Dönüştürme bir mutant genom14‘ e gen işlevsel bir kopyasını sunarak bir mutasyon kurtarmak için de kullanılabilir. Ayrıca, germline dönüştürme moleküler genetik teknikleri çok çeşitli taşıdır. Nakavt ve/veya gen işlevi tahlisiye yanı sıra, germline dönüştürme artırıcı bindirme15, gen bindirme16, Ektopik ifade Gal4 tabanlı17ve genom-wide mutagenesis18için kullanılabilir.
Daha yakın zamanlarda, sofistike genom düzenleme sağlayan araçlar geliştirilmiştir. Bu araçlar transkripsiyon Activator-Like efektör enzimler (TALEN) CRISPR/Cas9-nükleaz sistemi19,20içerir. Bu yeni araçların çift iplikçikli DNA ara hemen hemen her yerde hemen hemen tüm genom içinde ikna yeteneği araştırmacılar sundukları avantajdır. Bir kez bağlı, bu tatili katalizler hangi bir mühendislik yapı huzurunda homoloji yönetmen onarım veya silme veya ekleme hedeflenen gen tanıtmak katılmadan, homolog olmayan iki ucundan aracılığıyla onarılabilir yerine tüm genler veya genetik bölgeleri21,22. Ancak, bu yöntemlerin çok genç embriyo içine DNA, RNA ve/veya protein mikroenjeksiyon gerektirir.
Önemlisi, RNAi, nükleik asitler ve protein germline için kullanılan için kullanılan dsRNAs aksine dönüştürme ve genom düzenleme kolayca hücre zarlarında geçemez. Bu nedenle, mikroenjeksiyon plazmid DNA’lar, mRNA’ların ve/veya proteinler (böcek embriyo cellularizes önceYani ) sinsisyal blastoderm aşamasında yer almalıdır. Bu kritik bir faktör enjeksiyonları zamanlamasını yapar. Örneğin, Drosophila melanogasteriçinde embriyo12yumurta sonra iki saat içinde enjekte edilir gerekir. Bu nedenle, başarılı embriyonik mikroenjeksiyon Protokolü gelişimi için WCR yanı sıra precellular embriyo yeterli miktarda toplamak için en iyi yöntem dişi yumurta döşenmesi için en iyi koşulları dikkate almanız gerekir.
Toplamak ve precellular WCR embriyo microinjecting yöntemleri geliştirmek, WCR Biyoloji üzerinde ayı için moleküler genetik araçları geniş bir yelpazede getirmek için bir çaba gerektirir. Burada WCR araştırmada dönüşüm tabanlı teknikleri kullanmak başkalarına yardım etmek için ayrıntılı talimatlar, ipuçları ve püf noktaları, birlikte sağlamak. İşlevsel genomik çalışmalarda kullanılmak için WCR transgenik teknolojileri uzanan ek olarak bu teknikler de bunda ekonomik açıdan önemli test edilecek gen sürücü23,24 gibi güçlü yeni haşere kontrol stratejileri sağlar haşere.
Protocol
Representative Results
Discussion
WCR mikroenjeksiyon RNAi amacıyla dsRNAs ile bildirilen9olmasına rağmen bu precellular WCR embriyo, germline dönüştürme yürütmek için kritik bir işlem microinjecting için en iyi yöntemler kurmak için ilk protokoldür ve/veya CRISPR/Cas9 genom içinde bu tür düzenleme. Dönüşüm verimliliği olduğu gibi WCR embriyo başarılı mikroenjeksiyon birçok etkene bağlıdır. Aşağıda açıklanan bazı önemli konuları bu böceğin germline dönüştürme için bu iletişim kuralın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Monsanto Mısır Rootworm bilgi araştırma programı hibe tarafından desteklenen, numara AG/1005 (için MDL ve YC) ve başlangıç fonlar MDL için NCSU verin. FC hibe Monsanto’nun Mısır Rootworm bilgi araştırma programı (AG/1005) ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (MDL) sayı MCB-1244772 verin. Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin. FC ve MDL gebe ve deneyler tasarlanmış; FC, PW ve SP deneyler yapılır; FC ve MDL sonuçları analiz; ve FC, NG ve MDL el yazması yazdı. Biz Teresa O’Leary, William Klobasa ve Stephanie Gorski WCR eleme konusunda uzman onların yardım için teşekkür ederim. Ayrıca Dr. Wade Fransızca (USDA-ARS, Kuzey Merkez tarımsal araştırma laboratuvarı, Brookings, SD) laboratuar koloniler ve yetiştirme protokolleri sağlayarak kurmak için yumurta gönderiler için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5×7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
- Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
- Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
- Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. . Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , (1959).
- Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
- Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
- Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
- Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
- Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
- Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
- Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
- O’Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
- Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Jeggo, P. A. DNA breakage and repair. Adv Genet. 38, 185-218 (1998).
- Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
- Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
- Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
- Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
- Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
- Handler, A. M., James, A. A. . Insect transgenesis: methods and applications. , (2000).
- Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
- Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
- Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).
