En snabb och lättköpt Pipeline för generera genomisk punkt mutanter i C. elegans med CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Här presenterar vi en metod för att konstruera genomet hos C. elegans med CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins och homologi beroende reparation mallar.
Abstract
De klustrade regelbundet interspersed palindromic repetitioner (CRISPR) – CRISPR – associerade protein 9 (Cas9) prokaryota adaptiva immunförsvaret system har varit adjungerad som ett kraftfullt verktyg för exakt eukaryota genomet engineering. Här presenterar vi en snabb och enkel metod med chimära enda guide RNAs (sgRNA) och CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) för effektiv och exakt generering av genomisk punktmutationer i C. elegans. Vi beskriver ett försäljningsförlopp för val av sgRNA mål, homologi-regisserad reparation (HDR) malldesign, CRISPR-Cas9-RNP komplexbildande och leverans och en strategi för genotypning som gör den stabil och snabb identifieringen av korrekt redigerade djur. Vår strategi inte bara tillåter lättköpt generering och identifiering av önskad genomisk punkt muterade djur, men också underlättar upptäckt av andra komplexa ditsatta alleler i cirka 4-5 dagar med hög effektivitet och en minskad screening arbetsbelastning.
Introduction
Senaste tekniska framsteg radikalt förändrat och accelererade förmåga att just ingenjör genomen. I synnerhet har CRISPR-Cas9 systemet, som bygger på den RNA-guidad Amiiiiin Cas9 att inducera en dubbel strand paus (DSB) nära målet sekvensen av intresse, använts i stor utsträckning att korrekt ingenjör genomet hos majoriteten av modellorganismer som används i biomedicinsk forskning1,2,3,4. Avsevärt, har användningen av CRISPR-Cas9 olåst gen editering även i svåra arter som C. elegans5. Oavsett art, generera punktmutationer med CRISPR-Cas9 baserat genomet redigering system bygger på tre huvudkomponenter: 1) Cas9 Amiiiiin, 2) en enda guide RNA (sgRNA) som styr den Cas9 Amiiiiin till en mål-sekvens, och 3) en användare som utformats homologi-regisserad reparation (HDR) mallen som innehåller de önskade redigering(ar) intresse2.
Det finns flera metoder som kan användas för att införa riktade sgRNA och Cas9 nuclease in celler inklusive plasmid, RNA och viral-baserade leverans metoder6. Nyligen, direktleverans av pre-komplex sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) har vuxit fram som ett kraftfullt och effektivt verktyg i CRISPR-Cas9-baserade genomet redigering7. Direkt leverans av pre-komplex CRISPR-Cas9 RNPs har flera distinkta fördelar, nämligen: 1) RNPs förbifartsleden nöden för cellulära transkription och translation, 2) RNPs rensas snabbt, vilket kan öka specificiteten genom att minska tillgänglig tid för off-target klyvning och 3) RNPs innehåller inga främmande DNA/RNA-element som kringgår införandet av icke-infödda sekvenser i värd genomet genom slumpmässiga integration. Tillsammans ger dessa attribut sannolikt en kortlivad explosion av på målet CRISPR redigering samtidigt minimera off-target effekter.
Vi beskriver ett enkelt och effektivt protokoll för att införa platsspecifika genomiska förändringar i C. elegans. Detta protokoll innehåller inriktning sgRNA och enda stranded oligonukleotiden (ssODN) HDR malldesign, sgRNA-Cas9 RNP komplexbildande och leverans och en genotypning strategi för entydig identifiering av ordentligt redigerade djur. Använda denna strategi, inte bara kan platsspecifika ändringarna återvinnas, men andra icke-specifika ditsatta mutationer kan också återvinnas. Sålunda, vår strategi tillåter generationen av en alleliska serien använder en enda strategi, där både mono-allela, bi-allela, och ditsatta mutanter kan genereras i F1 generationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas9 systemet är ett kraftfullt och effektivt verktyg för att just ändra genomet hos modellorganismer. Här visar vi den chimära sgRNAs20 tillsammans med ssODN HDR mallar kan mycket effektiv generering av genomisk punktmutationer i C. elegans. Ännu viktigare, visar vi att RNP leverans producerar hög redigering effektivitet när fluorescens används som en markör för samtidig urval belyser den lätthet och tillförlitlighet av tekniken.
Majoritete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det finns inga intressekonflikter som relaterade till detta betänkande.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. . WormBook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?. Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
