Retroductal nanopartikel injektion til Murine submandibulære kirtel
Summary
Lokale medicinafgivelse til de submandibulære kirtler er af interesse i forståelse spytkirtel biologi og for udviklingen af nye lægemidler. Vi præsenterer en opdateret og detaljerede retroductal injektion protokol, designet til at forbedre leveringen nøjagtighed og eksperimenterende reproducerbarhed. Programmet præsenteres heri er levering af polymert nanopartikler.
Abstract
To fælles mål af spytkirtel therapeutics er forebyggelse og helbredelse af væv dysfunktion efter enten autoimmun eller stråling skader. Ved at levere lokalt bioaktive stoffer til spytkirtlerne, kan større væv koncentrationer opnås sikkert versus systemisk administration. Derudover off målvæv kan effekter fra ekstra glandulær ophobning af materiale drastisk reduceres. I denne henseende er retroductal injektion en almindeligt anvendt metode for at undersøge både spytkirtel biologi og patofysiologi. Retroductal administration af vækstfaktorer, primærelementer, adenoviral vektorer og lille molekyle narkotika har vist sig at støtte kirtel funktion i fastsættelsen af skade. Vi har tidligere vist effekten af en retroductally indsprøjtet nanopartikel-siRNA strategi at opretholde kirtel funktion efter bestråling. Her, en yderst effektiv og reproducerbar metode til at administrere nanomaterialer til murine submandibulære kirtel gennem Whartons kanalen er detaljeret (figur 1). Vi beskriver adgang til mundhulen og skitsere de nødvendige skridt til at cannulate Wharton kanalen, med yderligere observationer tjener som kvalitetskontrol under hele proceduren.
Introduction
Spytkirtel dysfunktion har mange etiologies, herunder Sjögrens syndrom, en autoimmun medieret tab af funktionelle sekretoriske væv og stråling induceret hyposalivation (RIH), en fælles sequella på hoved og hals kræft strålebehandling1. Tab af spyt funktion på grund af enten tilstand disponerer enkeltpersoner til mundtlige og systemisk infektion, huller i tænderne, fordøjelsessystemet og synke dysfunktion, tale værdiforringelse og store depression1,2,3. Som et resultat, lider livskvalitet væsentligt, med indgreb begrænset til palliation af symptomer i stedet kur4. For at undersøge nye behandlingsformer i vivo, er det af interesse at administrere bioaktive stoffer direkte til spytkirtel.
Retroductal injektion er en værdifuld metode til at levere bioaktive stoffer direkte til spytkirtlerne og teste effekten i sygdom, skade, eller under normale væv homøostase. De tre store spytkirtler er parotideale (PG), de submandibulære (SMG) og sublinguale (SLG), alle som Tom ind i mundhulen gennem ekskretionsorganerne kanaler. Anatomi af murin SMG tillader direkte adgang gennem cannulation af Whartons kanalen, ligger i gulvet i munden under tungen5. Efter cannulation, solvated medicin kan administreres direkte til SMG. Efter retroductal levering, ekstra glandulær diffusion er begrænset af den omkringliggende væv kapsel, som regulerer udvekslingen af materiale med omgivende strukturer6. SMG og dens kanalen er ligeledes struktureret i mennesker, og rutinemæssigt adgang til under SMG kirurgi og sialoendoscopy7. I mennesker og mus er PG ligeledes tilgængelige via Stensens kanal i buccale slimhinde8.
I murine modeller af RIH, er SMG retroductal injektion blevet brugt til at levere therapeutics herunder vækstfaktorer, primærelementer, adenoviral vektorer, cytokiner og antioxidant forbindelser at modulere den cellulære reaktion på skade, og reducere den resulterende væv skader5,9,10,11,12,13,14,15,16. Den mest bemærkelsesværdige kliniske succes af retroductal injektion er administrationen af adenoviral vektor til direkte udtryk for en vand kanal (Aquaporin 1; AQP1) hos patienter efter stråling for hoved og hals kræft17.
Tidligere har vi udviklet og vist effekten af en retroductally indsprøjtet polymere nanopartikel-siRNA system at beskytte spytkirtel funktion fra RIH11,18,19,20. Som en forlængelse af vores tidligere arbejde, her, vise vi vores protokol for retroductal SMG injektion ved hjælp af en fluorescently mærket nanopartikel (NP), som er i stand til at indlæse og levere ellers tungtopløselige stoffer21,22, 23.
Vi har syntetiseret NP fra diblock copolymer bestående af poly (styren-alt-maleinsyre anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) via reversible tilføjelse kæde fragmentering (TØMMERFLÅDE) polymerisering, som tidligere beskrevet21. Gennem udveksling af opløsningsmidler samles disse polymerer spontant selvstændige til micelle NP strukturer med en hydrofobe interior og hydrofile udvendige21. De nationale parlamenter er mærket med Texas-rød fluorophore at tillade kontrol af NP levering i kirtler uden at ofre dyr. Levende dyr imaging og SMG Immunhistokemi er vist på 1 t og 1 dag efter injektionen.
Denne opdaterede og reproducerbare cannulation protokol skal gøre det muligt for andre at nå retroductal injektion. Vi forventer, at denne raffineret teknik vil blive afgørende for i vivo undersøgelser og terapeutiske udvikling24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retroductal injektion er kritisk for lokaliserede medicinafgivelse til spytkirtel. Denne teknik har applikationer i screening terapeutiske agenter for betingelser herunder Sjögrens syndrom og RIH9,10,28. Direkte medicinafgivelse i SMG via retroductal injektion giver en afgørende fordel frem for systemisk administration i dens potentiale til at nedbringe ud-target effekter, herunder immun aktivering11. E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af den nationale Dental-Institut og Craniofacial forskning (NIDCR) og National Cancer Institute (NCI) af National Institutes of Health under Award antallet R56 DE025098, UG3 DE027695 og F30 CA206296. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health. Dette arbejde blev også støttet af NSF DMR 1206219 IADR Innovation i Oral Care Award (2016).
Vi vil gerne takke Jayne Gavrity for hendes hjælp i udfører IVIS eksperimenter. Vi vil gerne takke Karen Bentley for hendes input og bistand i udførelsen af EM. Vi vil gerne takke Pei-Lun Weng for hans hjælp med IHC. Vi vil gerne takke Matthew Ingalls for sin bistand i figur forberedelse. Vi vil gerne takke Dr. Elaine Smolock og Emily Wu for kritisk læsning af dette manuskript.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management. International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).
- Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G. Radiotherapy-induced salivary dysfunction: Structural changes, pathogenetic mechanisms and therapies. Archives of Oral Biology. 60 (12), 1802-1810 (2015).
- Dirix, P., Nuyts, S., Vander Poorten, V., Delaere, P., Van den Bogaert, W. The influence of xerostomia after radiotherapy on quality of life. Supportive Care in Cancer. 16 (2), 171-179 (2008).
- Vissink, A., et al. Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (4), 983-991 (2010).
- Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (7), 3268-3273 (1997).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: from the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta. 1812 (11), 1515-1521 (2011).
- Beahm, D. D., et al. Surgical approaches to the submandibular gland: A review of literature. International Journal of Surgery. 7 (6), 503-509 (2009).
- Zheng, C., Shinomiya, T., Goldsmith, C. M., Di Pasquale, G., Baum, B. J. Convenient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands. Oral diseases. 17 (1), 77-82 (2011).
- Zheng, C., et al. Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands. Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).
- Okazaki, Y., et al. Acceleration of rat salivary gland tissue repair by basic fibroblast growth factor. Archives of Oral Biology. 45 (10), 911-919 (2000).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Molecular Therapy. 15 (12), 2101-2106 (2007).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotechnic & Histochemistry. 84 (6), 253-260 (2009).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417-417 (2010).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL-6 modulation. Cancer Research. , (2016).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19403-19407 (2012).
- Arany, S., et al. Pro-apoptotic gene knockdown mediated by nanocomplexed siRNA reduces radiation damage in primary salivary gland cultures. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (6), 1955-1965 (2012).
- Benoit, D. S. W., Henry, S. M., Shubin, A. D., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. pH-responsive polymeric siRNA carriers sensitize multidrug resistant ovarian cancer cells to doxorubicin via knockdown of polo-like kinase 1. Molecular pharmaceutics. 7 (2), 442-455 (2010).
- Malcolm, D. W., Varghese, J. J., Sorrells, J. E., Ovitt, C. E., Benoit, D. S. W. The Effects of Biological Fluids on Colloidal Stability and siRNA Delivery of a pH-Responsive Micellar Nanoparticle Delivery System. ACS Nano. , (2017).
- Baranello, M. P., Bauer, L., Benoit, D. S. Poly(styrene-alt-maleic anhydride)-based diblock copolymer micelles exhibit versatile hydrophobic drug loading, drug-dependent release, and internalization by multidrug resistant ovarian cancer cells. Biomacromolecules. 15 (7), 2629-2641 (2014).
- Wang, Y., et al. Fracture-Targeted Delivery of β-Catenin Agonists via Peptide-Functionalized Nanoparticles Augments Fracture Healing. ACS Nano. 11 (9), 9445-9458 (2017).
- Baranello, M. P., Bauer, L., Jordan, C. T., Benoit, D. S. W. Micelle Delivery of Parthenolide to Acute Myeloid Leukemia Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 455-470 (2015).
- Kuriki, Y., et al. Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton’s Duct. Journal of Visualized Experiments. (51), e3074 (2011).
- Nair, R. P., Zheng, C., Sunavala-Dossabhoy, G. Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Wang, Y., Malcolm, D. W., Benoit, D. S. W. Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing. Biomaterials. 139 (Supplement C), 127-138 (2017).
- Hoffman, M. D., Van Hove, A. H., Benoit, D. S. W. Degradable hydrogels for spatiotemporal control of mesenchymal stem cells localized at decellularized bone allografts. Acta Biomaterialia. 10 (8), 3431-3441 (2014).
- Nguyen, C. Q., Yin, H., Lee, B. H., Chiorini, J. A., Peck, A. B. IL17: potential therapeutic target in Sjogren’s syndrome using adenovirus-mediated gene transfer. Laboratory Investigation. 91 (1), 54-62 (2011).
