Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón
Summary
Entrega local de la droga a las glándulas submaxilares es de interés en biología de la glándula salival de entendimiento y para el desarrollo de nuevas terapias. Presentamos un protocolo de inyección de retroductal actualizada y detallada, diseñado para mejorar entrega exactitud y reproducibilidad experimental. La aplicación presentada en este documento es el de nanopartículas poliméricas.
Abstract
Dos objetivos comunes de la terapéutica de la glándula salival son prevención y cura de la disfunción del tejido siguiendo ya sea autoinmune o lesión por radiación. Por entregar localmente compuestos bioactivos a las glándulas salivales, mayores concentraciones de tejido pueden lograrse con seguridad frente a la administración sistémica. Además, de tejido de la blanco los efectos de la acumulación extra glandular de material pueden dramáticamente reducidos. En este sentido, retroductal la inyección es un método ampliamente utilizado para la investigación de la glándula salival biología y Fisiopatología. Retroductal administración de factores de crecimiento, células primarias, vectores adenoviral y fármacos de molécula pequeña se ha demostrado para apoyar la función de la glándula en el entorno de la lesión. Previamente hemos demostrado la eficacia de una estrategia de nanopartículas-siRNA de retroductally inyectado para mantener la función de la glándula después de la irradiación. Aquí se detalla un método altamente eficaz y reproducible para administrar nanomateriales a la glándula submaxilar murina a través del conducto de Wharton (figura 1). Describir el acceso a la cavidad bucal y delinear los pasos necesarios al conducto de Wharton cannulate, con más observaciones que sirven como controles de calidad durante todo el procedimiento.
Introduction
Disfunción de las glándulas salivales tiene muchas etiologías, incluyendo el síndrome de Sjögren, una pérdida mediada autoinmune del tejido secretor funcional e hiposalivación inducida por la radiación (ROG), una secuela común de cabeza y cuello cáncer radioterapia1. Pérdida de la función salival debido a cualquier condición predispone a los individuos a oral y sistémica de la infección, caries dental, disfunción digestiva y deglución, debilitación de discurso y depresión mayor1,2,3. Como resultado, calidad de vida sufre significativamente, con las intervenciones que se limita a la paliación de los síntomas más que curar4. Para investigar nuevas terapias en vivo, es de interés para administrar compuestos bioactivos directamente a la glándula salival.
Retroductal inyectable es un método valioso para entregar compuestos bioactivos directamente a las glándulas salivales y comprobar la eficacia en la enfermedad, lesión, o en la homeostasis del tejido normal. Las tres glándulas salivales mayores son la parótida (PG), el submaxilar (SMG) y sublingual (SLG), todos de que está vacía en la cavidad bucal a través de conductos excretores. La anatomía de la murine SMG permite acceso directo a través de la canulación del conducto de Wharton, ubicada en el piso de la boca bajo la lengua5. Tras la canulación, fármacos solvatados pueden administrarse directamente en el SMG. Después del parto de retroductal, difusión extra glandular está limitada por la cápsula de tejido circundante que regula el intercambio de material con el que rodea las estructuras6. El SMG y su conducto están estructurados de manera similar en los seres humanos y habitualmente se acceden durante el SMG cirugía y sialoendoscopy7. En humanos y ratones, la PG es además accesible a través del conducto de Stensen en la mucosa bucal8.
En modelos murinos de RIH, inyección de retroductal SMG se ha utilizado para ofrecer terapéutica incluyendo factores de crecimiento, células primarias, vectores adenoviral, citoquinas y compuestos antioxidantes modulan la respuesta celular a la lesión, y reducir el tejido daño5,9,10,11,12,13,14,15,16. El más notable éxito clínico de retroductal inyectable es la administración de un vector adenoviral para dirigir la expresión de un canal de agua (Acuaporina 1; AQP1) en pacientes después de la radiación para cáncer de cabeza y cuello17.
Previamente, hemos desarrollado y demostrado la eficacia de un sistema de nanopartículas poliméricas-siRNA retroductally inyectada para proteger la función de la glándula salival de RIH11,18,19,20. Como una extensión de nuestro trabajo en el pasado, aquí, demostramos nuestro protocolo para la inyección de SMG de retroductal usando una nanopartícula fluorescente etiquetada (NP) capaz de cargar y entregar de lo contrario poco solubles drogas21,22, 23.
Se ha sintetizado lo NP de un copolímero del diblock compuesto de poli (estireno-alt-maleico anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) a través de la adición reversible cadena fragmentación (balsa) polimerización, tal como se describe anteriormente21. A través del intercambio de solvente, estos polímeros montan espontáneamente uno en estructuras de micelas NP con una hidrofóbica interior e hidrofílico exterior21. El NPs están marcado con rojo Texas fluoróforo para permitir la verificación de la entrega de la NP en las glándulas sin sacrificar el animal. Imágenes de animales en vivo y immunohistochemistry SMG se muestra en 1 h y 1 día después de la inyección.
Este actualizado y protocolo reproducible de la canalización debe permitir que otras personas lograr la inyección de retroductal. Esperamos que esta refinada técnica será fundamental para en vivo estudios y desarrollo terapéutico24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retroductal inyección es crítica para la entrega de la droga localizada en la glándula salival. Esta técnica tiene aplicaciones en la detección de agentes terapéuticos para las condiciones incluyendo el síndrome de Sjögren y RIH9,10,28. Directa del fármaco en el SMG vía la inyección de retroductal ofrece una ventaja clave sobre la administración sistémica en su potencial para reducir los efectos off-target, incluyen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de odontología y el Instituto Nacional de cáncer (NCI) de los institutos nacionales de salud Premio número R56 DE025098, DE027695 UG3 y F30 CA206296 Craniofacial Research (NIDCR). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. Este trabajo también fue apoyado por la NSF DMR 1206219 y la innovación de la IADR en Premio de Cuidado Oral (2016).
Nos gustaría agradecer a Jayne Gavrity por su ayuda en la realización de experimentos IVIS. Nos gustaría agradecer a Karen Bentley por su entrada y asistencia en la realización de EM. Nos gustaría agradecer su ayuda con IHC Weng Pei-Lun. Nos gustaría agradecer a Matthew Ingalls por su ayuda en la preparación de la figura. Nos gustaría agradecer al Dr. Elaine Smolock y Emily Wu lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management. International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).
- Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G. Radiotherapy-induced salivary dysfunction: Structural changes, pathogenetic mechanisms and therapies. Archives of Oral Biology. 60 (12), 1802-1810 (2015).
- Dirix, P., Nuyts, S., Vander Poorten, V., Delaere, P., Van den Bogaert, W. The influence of xerostomia after radiotherapy on quality of life. Supportive Care in Cancer. 16 (2), 171-179 (2008).
- Vissink, A., et al. Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (4), 983-991 (2010).
- Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (7), 3268-3273 (1997).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: from the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta. 1812 (11), 1515-1521 (2011).
- Beahm, D. D., et al. Surgical approaches to the submandibular gland: A review of literature. International Journal of Surgery. 7 (6), 503-509 (2009).
- Zheng, C., Shinomiya, T., Goldsmith, C. M., Di Pasquale, G., Baum, B. J. Convenient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands. Oral diseases. 17 (1), 77-82 (2011).
- Zheng, C., et al. Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands. Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).
- Okazaki, Y., et al. Acceleration of rat salivary gland tissue repair by basic fibroblast growth factor. Archives of Oral Biology. 45 (10), 911-919 (2000).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Molecular Therapy. 15 (12), 2101-2106 (2007).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotechnic & Histochemistry. 84 (6), 253-260 (2009).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417-417 (2010).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL-6 modulation. Cancer Research. , (2016).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19403-19407 (2012).
- Arany, S., et al. Pro-apoptotic gene knockdown mediated by nanocomplexed siRNA reduces radiation damage in primary salivary gland cultures. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (6), 1955-1965 (2012).
- Benoit, D. S. W., Henry, S. M., Shubin, A. D., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. pH-responsive polymeric siRNA carriers sensitize multidrug resistant ovarian cancer cells to doxorubicin via knockdown of polo-like kinase 1. Molecular pharmaceutics. 7 (2), 442-455 (2010).
- Malcolm, D. W., Varghese, J. J., Sorrells, J. E., Ovitt, C. E., Benoit, D. S. W. The Effects of Biological Fluids on Colloidal Stability and siRNA Delivery of a pH-Responsive Micellar Nanoparticle Delivery System. ACS Nano. , (2017).
- Baranello, M. P., Bauer, L., Benoit, D. S. Poly(styrene-alt-maleic anhydride)-based diblock copolymer micelles exhibit versatile hydrophobic drug loading, drug-dependent release, and internalization by multidrug resistant ovarian cancer cells. Biomacromolecules. 15 (7), 2629-2641 (2014).
- Wang, Y., et al. Fracture-Targeted Delivery of β-Catenin Agonists via Peptide-Functionalized Nanoparticles Augments Fracture Healing. ACS Nano. 11 (9), 9445-9458 (2017).
- Baranello, M. P., Bauer, L., Jordan, C. T., Benoit, D. S. W. Micelle Delivery of Parthenolide to Acute Myeloid Leukemia Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 455-470 (2015).
- Kuriki, Y., et al. Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton’s Duct. Journal of Visualized Experiments. (51), e3074 (2011).
- Nair, R. P., Zheng, C., Sunavala-Dossabhoy, G. Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Wang, Y., Malcolm, D. W., Benoit, D. S. W. Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing. Biomaterials. 139 (Supplement C), 127-138 (2017).
- Hoffman, M. D., Van Hove, A. H., Benoit, D. S. W. Degradable hydrogels for spatiotemporal control of mesenchymal stem cells localized at decellularized bone allografts. Acta Biomaterialia. 10 (8), 3431-3441 (2014).
- Nguyen, C. Q., Yin, H., Lee, B. H., Chiorini, J. A., Peck, A. B. IL17: potential therapeutic target in Sjogren’s syndrome using adenovirus-mediated gene transfer. Laboratory Investigation. 91 (1), 54-62 (2011).
