Retroductal Nanoparticle injeksjon til Murine Submandibular kjertel
Summary
Lokale narkotika-leveranser til submandibular kjertler er av interesse i forståelse salivary kjortelen biologi og utviklingen av romanen therapeutics. Vi presenterer en oppdatert og detaljert retroductal injeksjon protokoll, utformet for å forbedre levering nøyaktighet og eksperimentelle reproduserbarhet. Programmet presenteres her er levering av polymere nanopartikler.
Abstract
To felles mål av salivary kjortelen therapeutics er forebygging og helbredelse av vev dysfunksjon etter enten autoimmune eller stråling skader. Ved å levere lokalt bioaktive forbindelser til spyttkjertler, kan større vev konsentrasjoner trygt oppnås versus systemisk administrasjon. Videre av vevet kan effekter fra ekstra kjertel opphopning av materiale dramatisk nedsatte. I denne forbindelse er retroductal injeksjon en brukte metoden for å undersøke både salivary kjortelen biologi og patofysiologi. Retroductal administrasjonen av vekstfaktorer, Primærceller, adenoviral vektorer og små molekyl narkotika har vist seg å støtte kjertel-funksjonen i innstillingen for skade. Vi har tidligere vist effekten av en retroductally injisert hydrogenion-siRNA strategi for å opprettholde kjertel funksjon etter bestråling. Her, en svært effektiv og reproduserbar metode administrere nanomaterialer murine submandibular kjertel gjennom Wharton’s duct er detaljert (figur 1). Vi beskriver tilgang til munnhulen og skissere trinnene nødvendig å cannulate Wharton ledningskanal, med ytterligere observasjoner som kvalitetskontroller i hele denne prosedyren.
Introduction
Salivary kjortelen dysfunksjon har mange etiologies, inkludert Sjögrens syndrom, en autoimmun mediert tap av funksjonelle sekretoriske vev og stråling indusert hyposalivation (RIH), et felles sequella hode og nakke kreft strålebehandling1. Tap av salivary funksjon på grunn av forholdene predisponerer personer til muntlig og systemisk, tannråte, fordøyelsessystemet og svelge dysfunction, talefeil og store depresjonen1,2,3. Som et resultat, lider livskvalitet betraktelig, med intervensjonene begrenset til palliation av symptomer heller enn kur4. Undersøke romanen terapi i vivo, er det interessant å administrere bioaktive forbindelser direkte til det salivary kjortelen.
Retroductal injeksjon er en nyttig metode for å levere bioaktive forbindelser direkte til spyttkjertler og teste effekten i sykdom, skade, eller under normalt vev homeostase. Tre store spyttkjertler er Parodisk (PG), submandibular (SMG) og sublingvaltabletter (SLG), alle som Tom i munnhulen gjennom excretory kanaler. Anatomien i murint SMG tillater direkte tilgang gjennom cannulation av Wharton’s duct, i gulvet i munnen under tungen5. Etter den cannulation, solvated legemidler kan administreres direkte til SMG. Etter retroductal levering, ekstra kjertel Diffusjon er begrenset av omkringliggende vev kapsel som regulerer utveksling av materiale med omkringliggende strukturer6. SMG sine rør er tilsvarende strukturert hos mennesker og rutinemessig tilgang under SMG kirurgi og sialoendoscopy7. Hos mennesker og mus er PG også tilgjengelig via Stensens rør i bukkal mucosa8.
I murine modeller av RIH, er SMG retroductal injeksjon brukt til å levere therapeutics inkludert vekstfaktorer, Primærceller, adenoviral vektorer, cytokiner og antioksidant forbindelser å modulere cellulær respons til skade og redusere den resulterende vev skade5,9,10,11,12,13,14,15,16. Mest bemerkelsesverdige klinisk suksess retroductal injeksjon er administrasjon av adenoviral vektor til direkte uttrykk for en vann kanal (Aquaporin 1; AQP1) hos pasienter etter stråling for hode og nakke kreft17.
Vi har tidligere utviklet og vises effekten av en retroductally injisert polymere hydrogenion-siRNA system å beskytte salivary kjortelen funksjonen RIH11,18,19,20. Som en forlengelse av vår siste arbeid, her viser vi vår protokoll for retroductal SMG injeksjon bruker en fluorescently merket hydrogenion (NP) lasting og levere ellers dårlig løselig narkotika21,22, 23.
Vi har syntetisert NP fra en diblock kopolymer består av poly (styren-alt-maleic anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) gjennom reversibel tillegg kjeden fragmentering (FLÅTEN) polymerization, som beskrevet tidligere21. Gjennom løsemiddel utveksling samle disse polymerer spontant selv inn micelle NP strukturer med en hydrofobe interiør og hydrofile utvendig21. NPs er merket med Texas-rød fluorophore å tillate kontroll av NP leveres til kjertler uten å ofre dyr. Live dyr bildebehandling og SMG immunohistochemistry vises på 1 h og 1 dag etter injeksjon.
Dette oppdatert og reproduserbar cannulation protokollen bør aktivere andre til å oppnå retroductal injeksjon. Vi forventer at denne raffinerte teknikken blir avgjørende for i vivo studier og terapeutiske utvikling24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retroductal injeksjon er avgjørende for lokaliserte narkotika-leveranser til det salivary kjortelen. Denne teknikken har programmer i screening terapeutiske agenter for betingelser inkludert Sjøgrens syndrom og RIH9,10,28. Direkte narkotika-leveranser i SMG via retroductal injeksjon gir en viktig fordel over systemisk administrasjon i dens potensial for å redusere off-målet effekter, inkludert immun aktivisering<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av det nasjonale Institutt for Dental og Craniofacial forskning (NIDCR) og National Cancer Institute (NCI) av National Institutes of Health under prisen nummer R56 DE025098, UG3 DE027695 og F30 CA206296. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health. Dette arbeidet ble også støttet av NSF DMR 1206219 og IADR-innovasjon i muntlig bekymre Award (2016).
Vi vil gjerne takke Jayne Gavrity for henne hjelp i å utføre IVIS eksperimenter. Vi vil gjerne takke Karen Bentley for hennes inngang og hjelp i å utføre EM. Vi vil gjerne takke Pei-Lun Weng for hans hjelp med IHC. Vi vil gjerne takke Matthew Ingalls for hans hjelp figur forberedelse. Vi vil gjerne takke Dr. Elaine Smolock og Emily Wu for kritisk lesning av dette manuskriptet.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management. International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).
- Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G. Radiotherapy-induced salivary dysfunction: Structural changes, pathogenetic mechanisms and therapies. Archives of Oral Biology. 60 (12), 1802-1810 (2015).
- Dirix, P., Nuyts, S., Vander Poorten, V., Delaere, P., Van den Bogaert, W. The influence of xerostomia after radiotherapy on quality of life. Supportive Care in Cancer. 16 (2), 171-179 (2008).
- Vissink, A., et al. Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (4), 983-991 (2010).
- Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (7), 3268-3273 (1997).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: from the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta. 1812 (11), 1515-1521 (2011).
- Beahm, D. D., et al. Surgical approaches to the submandibular gland: A review of literature. International Journal of Surgery. 7 (6), 503-509 (2009).
- Zheng, C., Shinomiya, T., Goldsmith, C. M., Di Pasquale, G., Baum, B. J. Convenient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands. Oral diseases. 17 (1), 77-82 (2011).
- Zheng, C., et al. Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands. Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).
- Okazaki, Y., et al. Acceleration of rat salivary gland tissue repair by basic fibroblast growth factor. Archives of Oral Biology. 45 (10), 911-919 (2000).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Molecular Therapy. 15 (12), 2101-2106 (2007).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotechnic & Histochemistry. 84 (6), 253-260 (2009).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417-417 (2010).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL-6 modulation. Cancer Research. , (2016).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19403-19407 (2012).
- Arany, S., et al. Pro-apoptotic gene knockdown mediated by nanocomplexed siRNA reduces radiation damage in primary salivary gland cultures. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (6), 1955-1965 (2012).
- Benoit, D. S. W., Henry, S. M., Shubin, A. D., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. pH-responsive polymeric siRNA carriers sensitize multidrug resistant ovarian cancer cells to doxorubicin via knockdown of polo-like kinase 1. Molecular pharmaceutics. 7 (2), 442-455 (2010).
- Malcolm, D. W., Varghese, J. J., Sorrells, J. E., Ovitt, C. E., Benoit, D. S. W. The Effects of Biological Fluids on Colloidal Stability and siRNA Delivery of a pH-Responsive Micellar Nanoparticle Delivery System. ACS Nano. , (2017).
- Baranello, M. P., Bauer, L., Benoit, D. S. Poly(styrene-alt-maleic anhydride)-based diblock copolymer micelles exhibit versatile hydrophobic drug loading, drug-dependent release, and internalization by multidrug resistant ovarian cancer cells. Biomacromolecules. 15 (7), 2629-2641 (2014).
- Wang, Y., et al. Fracture-Targeted Delivery of β-Catenin Agonists via Peptide-Functionalized Nanoparticles Augments Fracture Healing. ACS Nano. 11 (9), 9445-9458 (2017).
- Baranello, M. P., Bauer, L., Jordan, C. T., Benoit, D. S. W. Micelle Delivery of Parthenolide to Acute Myeloid Leukemia Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 455-470 (2015).
- Kuriki, Y., et al. Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton’s Duct. Journal of Visualized Experiments. (51), e3074 (2011).
- Nair, R. P., Zheng, C., Sunavala-Dossabhoy, G. Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Wang, Y., Malcolm, D. W., Benoit, D. S. W. Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing. Biomaterials. 139 (Supplement C), 127-138 (2017).
- Hoffman, M. D., Van Hove, A. H., Benoit, D. S. W. Degradable hydrogels for spatiotemporal control of mesenchymal stem cells localized at decellularized bone allografts. Acta Biomaterialia. 10 (8), 3431-3441 (2014).
- Nguyen, C. Q., Yin, H., Lee, B. H., Chiorini, J. A., Peck, A. B. IL17: potential therapeutic target in Sjogren’s syndrome using adenovirus-mediated gene transfer. Laboratory Investigation. 91 (1), 54-62 (2011).
