Hier presenteren we een protocol voor het meten van de vasculaire lekkage geïnduceerd door intradermale toediening van permeabiliteit bevordering van agenten in de lymfkliertest huid. Deze techniek kan worden gebruikt om de mogelijkheid van moleculen te bevorderen of belemmeren van vasculaire lekkage of te bestuderen van de moleculaire mechanismen die vasculaire permeabiliteit regelen bepalen.
De primaire functie van het vasculaire endotheel in gewervelde organismen is om te dienen als een beveiligingsbarrière tussen het bloed en elk weefsel van het lichaam, waardoor de permeabiliteit van het endotheel bloedcellen, plasma macromoleculen en water aangepast volgens worden kan de fysiologische noodzaak. In bepaalde ziekten, zijn cytokines en groeifactoren die gericht zijn op het endotheel barrière om Transient vasculaire permeabiliteit; uitgebracht echter kan hun langdurige aanwezigheid chronische vasculaire hyperpermeability en daardoor beschadiging van weefsel oedeem. De Miles-bepaling is een in vivo techniek waarmee onderzoekers te bestuderen van vasculaire hyperpermeability via de proxy meting van vasculaire lekkage. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over het uitvoeren van deze procedure in de muis, die het meest gebruikte model-organisme is te onderzoeken zoogdieren fysiologie en pathologie. De procedure hiervoor is de intraveneuze injectie van Evans blauwe kleurstof op het etiket van de circulerende albumine gevolgd door meerdere intradermale injecties van permeabiliteit-inducerende stoffen en voertuig besturingsoplossingen in verzet tegen de flanken van de muis. Daarom lekken Evans blauwe kleurstof geleidelijk in de dermis, waar het zich ophoopt en voor de kwantificering als lekkage geïnduceerd door de permeabiliteit-inducerende agent ten opzichte van het voertuig kan worden geëxtraheerd. De Miles-test kan worden uitgevoerd in wild type of genetisch gemodificeerde Muismodellen en kan gecombineerd worden met drug administration te bestuderen van de moleculaire mechanismen die regelen vasculaire permeabiliteit en identificeren van agenten/doelstellingen staat inducerende of blokkeren hyperpermeability.
De primaire functie van het cardiovasculair systeem is om de overdracht van gassen, voedingsstoffen en afvalstoffen tussen de omloop en de weefsels in alle organen. Bloedvaten hebben orgel-specifieke niveaus van basale permeabiliteit toe te staan dergelijke uitwisselingen1. Bloedvaten in de nieren zijn bijvoorbeeld zeer doorlaatbare, terwijl de bloed-hersen-barrière een strakke, zeer ondoordringbare interface2,3,4 vormt. De endotheliale cellen die de binnenbekleding van bloedvaten vormen een fysieke barrière tussen het verkeer en de onderliggende weefsels en vasculaire permeabiliteit regelen op een orgel-specifieke wijze. Bepaalde prikkels veroorzaken echter een gedeeltelijke verdeling van het endotheel blok te verhogen van de vloeibare extravasation van het verkeer in het interstitium boven het basale niveau1. Dergelijke hyperpermeability wordt waargenomen, bijvoorbeeld op locaties van weefseltrauma, in ontsteking, tumoren, tijdens sepsis, in de ogen met neovascular ziekte of in de hersenen en het hart, wanneer weefsel ischemie als gevolg van een beroerte of hartinfarct, respectievelijk optreedt 5 , 6 , 7 , 8. Wanneer chronisch verhoogd, de hyperpermeability leidt tot oedeem, die op hun beurt weefselschade, zoals verlies van visie in oog ziekte9 veroorzaakt. Modelleren van de vasculaire hyperpermeability reactie is dus wenselijk voor het begrijpen van de mechanismen die endothelial permeabiliteit verhogen en voor het testen van de werkzaamheid van agenten die zijn ontworpen voor de remming van dit.
De Miles-bepaling is een gevestigde, gebruikte en relatief eenvoudige techniek, die vasculaire lekkage in vivo als een surrogaat meting van vasculaire hyperpermeability maatregelen. Hoewel het neemt geen rekening gehouden met factoren die vasculaire lekkage onafhankelijk van endothelial barrière verordening, zoals bloeddruk of doorbloeding verhogen kunnen, compounding de Miles-bepaling over het algemeen wordt verondersteld te bieden een betrouwbare methode om te evalueren de permeabiliteit-modulerende activiteit van stoffen en de signalering bemiddelaars ter bevordering van hun activiteit te identificeren. Dienovereenkomstig, de bepaling van Miles is integraal deel uitmaakt van tal van studies die hebben aangegeven bemiddelaars/mediators van vasculaire hyperpermeability en hun mechanismen van actie10,11,12,13, 14,15, zoals de vasculaire endotheliale groeifactor VEGF-A dat werd oorspronkelijk geïdentificeerd als de vasculaire permeabiliteit factor VPF16.
Oorspronkelijk ontwikkeld door mijlen en mijlen om te studeren vasculaire permeabiliteit van cavia’s17, werd hun assay later aangepast voor het gebruik van muizen, die nu de modelorganisme voor keuze ophelderen van de moleculaire mechanismen van vasculaire permeabiliteit verordening als gevolg van hun exquise geschiktheid voor genetische manipulatie. Evans blauwe kleurstof is kort, intraveneus geïnjecteerd in volwassen muizen en toegestaan om te circuleren gedurende 30 minuten (Figuur 1). Permeabiliteit-inducerende stoffen ten opzichte van de controle van het voertuig zijn dan intradermaal geïnjecteerd in meerdere sites op tegengestelde flanken van de muis voor het opwekken van vasculaire lek (Figuur 1). Bijgevolg, albumine gebonden Evans blauwe kleurstof extravasates en hoopt zich op in de dermis (Figuur 1). Na het humaan doden de muis, Evans blauw wordt gewonnen uit de dermis en het niveau van vasculaire lek berekend als een ratio van test stof naar voertuig-geïnduceerde optische dichtheid (Figuur 2).
Sinds zijn eerste beschrijving in 195217, heeft de bepaling van de Miles onderzoekers voorzien van een relatief snelle, eenvoudige en betrouwbare methode voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van vasculaire hyperpermeability. Bijvoorbeeld, is de bepaling van Miles gebruikt voor het testen van het vermogen en/of sterkte van verschillende agenten voor het opwekken van hyperpermeability19,20,21 of voor het testen van de werkzaamheid van hyperpermeability blokkeren agenten8 ,22,23. Een ander voorbeeld: agenten die vasculaire permeabiliteit veroorzaken zijn getest in genetisch gemodificeerde muizen en hun littermate-besturingselementen om te bepalen wat de vereisten van de specifieke receptoren en signaal transducing eiwitten voor ligand-geïnduceerde hyperpermeability Reacties10,11,12,13,14,15,20,23. Meerdere aangepaste versies van de Miles assay hebben sindsdien gebruikt, bijvoorbeeld met betrekking tot de tracer gebruikt. Dus, blauwe Evans heeft vervangen in sommige studies met fluorescentie-label van verschillende grootte of microsferen11,13dextrans.
Het belangrijkste voordeel van de Miles bepaling over andere testen om vasculaire hyperpermeability mechanismen te onderzoeken is dat het relatief gemakkelijk uit te voeren en geen dure apparatuur vereist. Bovendien, als een in vivo techniek, deze bepaling modellen vasculaire lekkage in de context van intact bloedvaten, in tegenstelling tot het meten van lekkage via testen in vitro zoals trans goed flux testen of trans endothelial elektrische weerstand) TEER) testen, die zich, alleen, op het endotheel enkelgelaagde concentreren. De alternatieve in vivo tests van vasculaire hyperpermeability afwijken van de hier beschreven met behulp van een verschillende bezorgingsroute voor de hyperpermeability-inducerende agent of door het analyseren van vasculaire lekkage op verschillende locaties, voor Miles-bepaling voorbeeld door systemische afgifte van een agent via de ader van de staart gevolgd door vasculaire lekkage examen in de longen of de luchtpijp11,13,15. Een beperking van de Miles-bepaling is dat de intradermale injectie van bepaalde agentia kan in principe ook van invloed zijn bloeddruk en stroom naast endothelial barrière verstoring en dus ook indirect invloed vasculaire permeabiliteit. Echter deze test onlangs is gebleken voor het meten van de vasculaire permeabiliteit geïnduceerd door VEGF-A onafhankelijk van de gevolgen van de systemische bloeddruk15. Een andere beperking van de Miles-bepaling is dat vasculaire bedden in verschillende weefsels en anders op permeabiliteit-bevordering van agenten, en resultaten van een bepaling van de Miles in de huid reageert, daarom mogen geen vertegenwoordiger, bijvoorbeeld, van wat er gebeurt de longen of hersenen.
De leeftijd en het gewicht van het dier invloed kunnen zijn op de lekkage waargenomen in de bepaling van Miles. Om te minimaliseren van het effect van deze variabelen, onderzoekers nestgenoten moeten gebruiken of ook grootte en leeftijd van muizen als besturingselementen. Bij de beoordeling van muis mutanten voor een bepaald gen van belang, moeten de muizen door middel van een heterozygoot versus heterozygoot fokken strategie en wildtype nestgenoten gebruikt als besturingselementen worden gegenereerd. Bovendien is het raadzaam om snel omkeerbare gas anesthetica, zoals Isofluraan, gebruiken om te voorkomen dat vasoconstrictie, die is beschreven voor sommige verdoving drug toegediend via injecties parenterale24,25. De injectie van Evans blauwe kleurstof in de ader van de laterale staart muis is een cruciale stap in dit protocol en de kwaliteit van het experiment en de gegevens sterk kan beïnvloeden. Dus, onderzoekers moet bevoegd zijn op het uitvoeren van de staart ader injecties en zal waarschijnlijk moeten voorafgaande ervaring of praktijk voordat u begint die de mijl assay experimenteren. Ook kunnen onderzoekers gebruiken andere intraveneuze routes Evans blauw, zoals retro-orbitaal injectie als zij ervaring met het leveren. Intradermale injectie van permeabiliteit-bevordering van oplossingen agent-onafhankelijke schade aan de huid kunnen veroorzaken. Daarom moeten intradermale injecties mag niet hoger zijn dan 20 µl in volume, altijd worden uitgevoerd in het bijzijn van de histamine-remmer en genormaliseerd naar voertuig controle injecties.
De Miles-bepaling is gebruikt door vele onderzoekers te evalueren van de onderdelen van de VEGF-A signalering pathway, bijvoorbeeld omdat de VEGF-A-geïnduceerde vasculaire permeabiliteit veroorzaakt ascites in kanker patiënten16 en visie-afbreuk te doen aan oedeem in verschillende neovascular oog ziekte7. Dus, wij en anderen hebben de Miles-bepaling gebruikt om te vergelijken van VEGF-A geïnduceerde vasculaire lekkage in muizen die genetisch zijn gewijzigd om een gebrek aan bepaalde onderdelen van de VEGF-A signalering trapsgewijs12,13,14, 15 , 20 , 23. onze recent onderzoek met behulp van deze aanpak is gebleken dat de voornaamste pathologische VEGF-A isovorm, VEGF165, via een complex van VEGFR2 en NRP1 signalen, waarin het NRP1 cytoplasmatische domein de ABL kinase-gemedieerde activering van SRC familie kinases bevordert voor wekken een reactie van hyperpermeability14. VEGFA ook bevordert groei van bloedvaten en daarom therapeutisch kan worden gebruikt om te herstellen bloedstroom ischemische weefsels als haar hyperpermeability activiteiten specifiek kunnen worden geremd. Onderzoek het ophelderen van het moleculaire mechanisme dat VEGF-A reacties van vasculaire endotheliale cellen naar vasculaire hyperpermeability stuurt zou daarom identificeren trajecten die kunnen selectief worden gemanipuleerd om het remmen van pathologische VEGF-A veroorzaakt oedeem in ziekten, zoals kanker of ischemische oogziekte. De Miles bepaling zal ongetwijfeld blijven een nuttige methode ter ondersteuning van deze en vele andere soorten functionele studies ophelderen van de moleculaire regulatoren en effectoren van vasculaire hyperpermeability.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Laura Denti, Valentina Senatore en het personeel van de biologische hulpbronnen Unit van de UCL Institute van oftalmologie voor hulp bij muis veehouderij en Camille Charoy voor technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Medical Research Council (heer/N011511/1) C. Ruhrberg en een Britse hart Stichting PhD studententijd aan J.T. Brash (FS/13/59/30649).
Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml – 8 mm – 30G | BD | 324826 | |
Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Mouse restrainer | |||
Heat chamber | |||
Hair clippers | |||
Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
Scalpal | |||
Blunt scissor | |||
Forceps | |||
Eppendorf tubes | |||
Heatblock | |||
Cork board | |||
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |