Aquí, presentamos un protocolo para medir la salida vascular inducida por la administración intradérmica de agentes de promoción de permeabilidad en la piel murina. Esta técnica puede utilizarse para determinar la capacidad de las moléculas para promover o inhibir la salida vascular o a estudiar los mecanismos moleculares que regulan la permeabilidad vascular.
La función principal del endotelio vascular en los organismos vertebrados es servir como una barrera entre la sangre y cada tejido del cuerpo, por el que se pueden adaptar según la permeabilidad del endotelio a agua, macromoléculas del plasma y células sanguíneas la necesidad fisiológica. En ciertas enfermedades, citoquinas y factores de crecimiento son liberados que la barrera endotelial para aumentar transitoriamente la permeabilidad vascular; sin embargo, su presencia prolongada puede provocar hiperpermeabilidad vascular crónica y edema lo dañan el tejido. El ensayo de millas es una técnica en vivo que permite a los investigadores estudiar la hiperpermeabilidad vascular a través de la medición de proxy de salida vascular. Presentamos un protocolo detallado sobre cómo realizar este procedimiento en el ratón, que es el organismo modelo más ampliamente utilizado para estudiar la patología y fisiología mamífera. El procedimiento consiste en la inyección intravenosa del tinte de azul de Evans para la albúmina circulante seguida de múltiples inyecciones intradérmicas de agentes inductores de permeabilidad y soluciones de control de vehículo en oposición flancos del ratón de la etiqueta. En consecuencia, colorante azul de Evans pierde gradualmente en la dermis, donde se acumula y puede ser extraída para su cuantificación como fuga inducida por el agente de inducción de permeabilidad en relación con el vehículo. El ensayo de millas se puede realizar en tipo salvaje o genéticamente modificado modelos de ratón y puede combinarse con la administración de drogas para el estudio de mecanismos moleculares que regulan la permeabilidad vascular e identifican agentes/objetivos capaces de inducir o de bloqueo hiperpermeabilidad.
La función principal del sistema cardiovascular es permitir a la transferencia de gases, nutrientes y deshechos entre la circulación y los tejidos en todos los órganos. Los vasos sanguíneos tienen niveles de órgano-específicas de permeabilidad basal para permitir tales intercambios1. Por ejemplo, los vasos sanguíneos en el riñón son muy permeables, mientras que la barrera hemato encefálica forma un apretado y muy impenetrable interfaz2,3,4. Las células endoteliales que forman el revestimiento interno de los vasos sanguíneos proveen una barrera física entre la circulación y los tejidos subyacentes y regulan la permeabilidad vascular de manera órgano-específicas. Sin embargo, ciertos estímulos provocan una interrupción parcial de la barrera endotelial al aumentar la extravasación de líquido de la circulación en el intersticio por encima de los niveles básicos1. Tal hiperpermeabilidad se observa, por ejemplo, en sitios de trauma tisular, inflamación, tumores, durante la sepsis, en ojos con enfermedad neovascular o en el cerebro y el corazón, cuando se produce isquemia del tejido debido a un accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, respectivamente 5 , 6 , 7 , 8. cuando crónicamente elevados, hiperpermeabilidad conduce a edema, que a su vez provoca daño a los tejidos, tales como pérdida de visión en el ojo la enfermedad9. Así, es deseable para la comprensión de los mecanismos que aumentan la permeabilidad endotelial y poner a prueba la eficacia de agentes diseñados para inhibir este modelado de la respuesta de la hiperpermeabilidad vascular.
El ensayo de millas es una técnica bien establecida, utilizada y relativamente simple que mide la salida vascular en vivo como una medida sustituta de la hiperpermeabilidad vascular. Aunque no toma en cuenta composición de factores que pueden aumentar la salida vascular independientemente de la regulación de la barrera endotelial, como presión arterial o la circulación sanguínea, el análisis de Miles generalmente está pensado para proporcionar un método confiable para evaluar la actividad de modulación de la permeabilidad de las sustancias e identificar los mediadores de señalización que promueven su actividad. En consecuencia, el ensayo de Miles ha sido parte integral de numerosos estudios que han identificado mediadores de la hiperpermeabilidad vascular y sus mecanismos de acción10,11,12,13, 14,15, como el factor de crecimiento endotelial vascular VEGF-A que fue originalmente identificado como el factor de permeabilidad vascular VPF16.
Originalmente desarrollado por millas y millas para el estudio de la permeabilidad vascular en conejillos de Indias17, su ensayo fue adaptado posteriormente al uso de ratones, que son ahora el organismo modelo de elección para dilucidar los mecanismos moleculares de la permeabilidad vascular Reglamento debido a su exquisita adecuación a la manipulación genética. Brevemente, colorante de azul de Evans por vía intravenosa es había inyectado en ratones adultos y permitir que circule durante 30 minutos (figura 1). Agentes inductores de permeabilidad versus control del vehículo luego se inyectan por vía intradérmica en múltiples sitios de oposición flancos del ratón para inducir la fuga vascular (figura 1). En consecuencia, albúmina-limitan Evans tinte azul extravasates y se acumula en la dermis (figura 1). Después de sacrificar humanitariamente el ratón, azul de Evans se extrae de la dermis y el nivel de fuga vascular calcula como un cociente de la prueba a vehículo-inducidas por sustancias densidad óptica (figura 2).
Desde su primera descripción en 195217, el ensayo de Miles ha proporcionado los investigadores un método relativamente rápido, sencillo y fiable para estudiar los mecanismos moleculares de la hiperpermeabilidad vascular. Por ejemplo, el ensayo de Miles se ha utilizado para probar la capacidad o potencia de los diferentes agentes para inducir la hiperpermeabilidad19,20,21 para probar la eficacia de la hiperpermeabilidad bloqueando agentes8 ,22,23. Como otro ejemplo, agentes que inducen la permeabilidad vascular se han probado en ratones modificados genéticamente y sus controles de littermate para determinar los requerimientos de receptores específicos y la señal de transducción de proteínas inducida por el ligando de la hiperpermeabilidad respuestas10,11,12,13,14,15,20,23. Varias versiones modificadas del ensayo Miles han ya utilizadas, por ejemplo con respecto al trazador utilizado. Así, el azul de Evans ha sido sustituida en algunos estudios con dextranos marcados con fluorescencia de diferentes tamaños o microesferas11,13.
La principal ventaja del ensayo Miles sobre otros ensayos para investigar mecanismos de hiperpermeabilidad vascular es que es comparativamente fácil de realizar y no requiere de equipo costoso. Además, como una técnica en vivo , esta salida vascular de modelos de análisis en el contexto de vasos intactos, frente a la fuga a través de la medición en vitro ensayos tales como trans bien ensayos de flujo o trans endotelial resistencia eléctrica ( Ensayos de TEER), que se centran, exclusivamente, en la monocapa endotelial. Los ensayos alternativos en vivo de hiperpermeabilidad vascular pueden diferir el análisis de Miles aquí descrito utilizando una ruta de entrega diferentes para el agente de inducción de hiperpermeabilidad o mediante el análisis de fuga vascular en diferentes sitios, para ejemplo de la entrega sistémica de un agente a través de la vena de la cola seguido del examen de salida vascular en los pulmones o la tráquea11,13,15. Una limitación del análisis de Miles es que la inyección intradérmica de ciertos agentes puede, en principio, también influyen en la presión arterial y el flujo además de alteración de barrera endotelial y, por lo tanto, influyen también indirectamente en la permeabilidad vascular. Sin embargo, este ensayo se ha demostrado recientemente para medir la permeabilidad vascular inducida por VEGF-A independientemente de efectos sobre la presión arterial sistémica15. Otra limitación del análisis de Miles es que camas vasculares en diferentes tejidos pueden responder diferentemente a agentes de promoción de la permeabilidad y los resultados obtenidos con un ensayo de Miles en la piel, por lo tanto, no sean representante, por ejemplo, de lo que ocurre en la pulmón o el cerebro.
Edad y peso del animal pueden influir en la fuga observada en el ensayo Miles. Para minimizar el efecto de estas variables, los investigadores deben utilizar hermanos de camada o similar tamaño y de ratones como controles. Evaluación de mutantes de ratón para un determinado gen de interés, se deben generar ratones a través de un heterocigoto versus crianza heterozigótico estrategia y wildtype hermanos de camada utilizados como controles. Por otra parte, es recomendable utilizar anestésicos gas rápidamente reversible, como el isoflurano, para evitar la vasoconstricción, que ha sido descrita por algún fármaco anestésico administrado por vía parenteral inyecciones24,25. La inyección de colorante azul de Evans en la vena lateral de la cola de ratón es un paso crítico en este protocolo y puede influir grandemente en la calidad de la experiencia y los datos. Así, los investigadores deben ser competentes en la ejecución de las inyecciones de vena de la cola y es probable que necesite previa experiencia o práctica antes de empezar que las millas ensayo experimentarán. También, los investigadores pueden utilizar otras rutas intravenosa para entregar a Evans blue, como la inyección de retro-orbital si tienen experiencia con él. Inyección intradérmica de permeabilidad-promover soluciones pueden dañar independiente del agente a la piel. Por lo tanto, inyecciones intradérmicas no debe exceder 20 μl en el volumen, deben siempre ser realizadas en presencia del inhibidor de la histamina y normalizadas a las inyecciones de control del vehículo.
El ensayo de millas se ha utilizado por muchos investigadores a evaluar los componentes de la vía señalización de VEGF-A, por ejemplo, debido a la permeabilidad vascular inducida por el VEGF-A provoca ascitis en pacientes de cáncer16 y edema pérdida de visión en varios neovascular ojo la enfermedad7. Por lo tanto, nosotros y otros hemos utilizado el ensayo de Miles para comparar VEGF-A salida vascular inducida en ratones que han sido modificados genéticamente para carecer de componentes específicos del VEGF-A señalización cascada12,13,14, 15 , 20 , 23. nuestro reciente estudio usando este acercamiento reveló que la principal isoforma de VEGF-A patológica, VEGF165, señala a través de un complejo de VEGFR2 y NRP1, en el que el dominio citoplásmico NRP1 promueve la activación mediada por la cinasa ABL de quinasas familia SRC para evocar una respuesta de hiperpermeabilidad14. VEGFA también promueve el crecimiento de vasos sanguíneos y por lo tanto, podría ser utilizado terapéuticamente para restablecer el flujo sanguíneo a los tejidos isquémicos si sus actividades de hiperpermeabilidad pueden ser inhibidas específicamente. Investigación elucidar el mecanismo molecular que VEGF-A las respuestas de las células endoteliales vasculares hacia la hiperpermeabilidad vascular podría, por lo tanto, identificar las vías que se pueden manipular selectivamente inhibiendo patológico edema inducida por VEGF-A en enfermedades como cáncer o enfermedad ocular isquémico. El ensayo de millas, sin duda, seguirá siendo un método útil para apuntalar estos y muchos otros tipos de estudios funcionales para aclarar moleculares reguladores y efectores de la hiperpermeabilidad vascular.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Laura Denti, Valentina Senatore y el personal de la unidad de recursos biológicos en el Instituto de Oftalmología de UCL para ayuda con la cría de ratón y Camille Charoy para soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por una beca del Medical Research Council (Señor/N011511/1) C. Ruhrberg y una beca de británico doctorado Fundación de corazón a J.T. Brash (FS/13/59/30649).
Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml – 8 mm – 30G | BD | 324826 | |
Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Mouse restrainer | |||
Heat chamber | |||
Hair clippers | |||
Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
Scalpal | |||
Blunt scissor | |||
Forceps | |||
Eppendorf tubes | |||
Heatblock | |||
Cork board | |||
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |