Aqui, apresentamos um protocolo para medir o vazamento vascular induzido pela administração intradérmica de agentes de promoção de permeabilidade na pele murino. Esta técnica pode ser usada para determinar a capacidade das moléculas de promover ou inibir vazamento vascular ou para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular.
A principal função do endotélio vascular em organismos vertebrados é servir como uma barreira entre o sangue e cada tecido do corpo, através do qual a permeabilidade do endotélio, de células do sangue, macromoléculas do plasma e água pode ser adaptada de acordo com a necessidade fisiológica. Em certas doenças, citocinas e fatores de crescimento são liberados em que se destinam a barreira endotelial para aumentar transitoriamente a permeabilidade vascular; no entanto, sua presença prolongada pode causar hyperpermeability vascular crônica e edema do tecido-prejudiciais desse modo. O ensaio de milhas é uma técnica na vivo que permite aos pesquisadores estudar hyperpermeability vascular através da medição de proxy de escapamento vascular. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado sobre como executar esse procedimento no mouse, que é o organismo modelo mais amplamente usado para estudar patologia e fisiologia dos mamíferos. O procedimento envolve a injeção intravenosa de corante azul de Evans para rotular a albumina circulante seguida por múltiplas injecções intradérmicas de agentes de indução permeabilidade e soluções de controle de veículos em oposição os flancos do mouse. Por conseguinte, corante azul de Evans gradualmente vaza para a derme, onde se acumula e pode ser extraído para quantificação como escapamento induzida pelo agente indutor de permeabilidade em relação ao veículo. O ensaio de milhas pode ser executado em tipo selvagem ou geneticamente modificado em modelos do rato e pode ser combinado com a administração de drogas para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular e identificam agentes/metas capazes de induzir ou bloqueio hyperpermeability.
A principal função do sistema cardiovascular é permitir a transferência de gases, nutrientes e resíduos entre a circulação e tecidos em todos os órgãos. Vasos sanguíneos têm níveis de órgão específico de permeabilidade basal para permitir tais intercâmbios1. Por exemplo, os vasos sanguíneos nos rins são altamente permeáveis, enquanto a barreira hemato-encefálica constitui uma interface altamente impenetrável e apertado2,3,4. As células endoteliais que formam o revestimento interno dos vasos sanguíneos fornecem uma barreira física entre a circulação e tecidos subjacentes e regulam a permeabilidade vascular de forma órgão específico. No entanto, certos estímulos causam um colapso parcial da barreira endotelial para aumentar o extravasamento de fluido de circulação para o interstício acima os níveis basais de1. Tal hyperpermeability é observado, por exemplo, em locais de trauma do tecido, na inflamação, tumores, durante a sepse, nos olhos com doença neovascular ou no cérebro e coração, quando a isquemia do tecido ocorre devido a um acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio, respectivamente 5 , 6 , 7 , 8. quando cronicamente elevada, hyperpermeability leva ao edema, que por sua vez, provoca danos nos tecidos, tais como perda de visão no olho doença9. Assim, a resposta vascular hyperpermeability de modelagem é desejável para compreender os mecanismos que aumentam a permeabilidade endotelial e para testar a eficácia de agentes projetado para inibir isto.
O ensaio de milhas é uma técnica bem estabelecida, comumente usada e relativamente simples que mede escapamento vascular na vivo como uma medida de substituto de hyperpermeability vascular. Mesmo que isso não leva em conta a composição de fatores que podem aumentar o vazamento vascular independentemente do Regulamento da barreira endotelial, tais como pressão arterial ou o fluxo de sangue, o ensaio de Miles geralmente é pensado para fornecer um método confiável para avaliar o permeabilidade-modulando a atividade de substâncias e identificar os sinalização mediadores que promovem a sua actividade. Nesse sentido, o ensaio de Miles tem sido parte integrante de inúmeros estudos que identificaram mediadores de hyperpermeability vascular e seus mecanismos de ação10,11,12,13, 14,15, como o fator de crescimento vascular endotelial VEGF-A que foi originalmente identificada como o fator de permeabilidade vascular VPF16.
Originalmente desenvolvido por milhas e milhas para estudar a permeabilidade vascular em cobaias17, seu ensaio foi posteriormente adaptado para usando ratos, que são agora o organismo modelo de escolha para elucidar os mecanismos moleculares da permeabilidade vascular Regulamento, devido a sua excelente adequação para manipulação genética. Brevemente, corante azul de Evans por via intravenosa é injetado em ratos adultos e autorizado a circular por 30 minutos (Figura 1). Agentes de indução permeabilidade contra o controle do veículo em seguida são injetados por via intradérmica em vários sites em opostos os flancos do rato para induzir vazamento vascular (Figura 1). Por conseguinte, albumina ligados a Evans corante azul extravasates e acumula-se na derme (Figura 1). Após abate humanamente o mouse, azul de Evans é extraído da derme e o nível de vazamento vascular calculado como uma relação do teste de substância para veículo-induzida de densidade óptica (Figura 2).
Desde sua primeira descrição em 195217, o ensaio de Miles forneceu pesquisadores com um método relativamente rápido, simples e confiável para estudar os mecanismos moleculares de hyperpermeability vascular. Por exemplo, o ensaio de Miles tem sido usado para testar a capacidade e/ou potência dos diferentes agentes para induzir hyperpermeability19,20,21 ou para testar a eficácia do bloqueio hyperpermeability agentes8 ,22,23. Como outro exemplo, agentes que induzem a permeabilidade vascular foram testados em ratos geneticamente modificados e seus controles littermate para determinar os requisitos de receptores específicos e sinal transducing proteínas para hyperpermeability induzida pelo ligante respostas10,11,12,13,14,15,20,23. Várias versões modificadas do ensaio Miles desde tem sido usadas, por exemplo no que diz respeito o palpador usado. Assim, azul de Evans tem sido substituída em alguns estudos com fluorescência-etiquetada dextranos de tamanhos diferentes ou microesferas11,13.
A principal vantagem do ensaio Miles sobre outros ensaios para investigar mecanismos hyperpermeability vascular é que é relativamente fácil de executar e não requer equipamento caro. Além disso, como uma em vivo técnica, este vazamento vascular modelos de ensaio no contexto de vasos intactos, ao contrário de vazamento através de medição em vitro ensaios tais como trans bem ensaios de fluxo ou trans-resistência elétrica endotelial ( Ensaios TEER), que incidem, unicamente, sobre a monocamada endotelial. Os ensaios alternativos na vivo de hyperpermeability vascular podem diferir o Miles ensaio descrito aqui, utilizando uma rota de entrega diferente para o agente indutor de hyperpermeability ou analisando o escapamento vascular em locais diferentes, para exemplo pela entrega sistémica de um agente através da veia da cauda seguido de exame de escapamento vascular nos pulmões ou a traqueia11,13,15. Uma limitação do ensaio Miles é que a injeção intradérmica de certos agentes pode, em princípio, também influenciam a pressão arterial e fluxo além do rompimento da barreira endotelial e, portanto, influenciar a permeabilidade vascular também indiretamente. No entanto, este ensaio recentemente tem sido mostrado para medir a permeabilidade vascular induzida por VEGF-A, independentemente de efeitos na pressão arterial sistêmica15. Outra limitação do ensaio Miles é que camas vasculares em tecidos diferentes podem responder diferentemente a permeabilidade-promoção agentes e os resultados obtidos com um ensaio de Miles na pele podem, portanto, não ser representativa, por exemplo, do que ocorre na pulmão ou cérebro.
Idade e peso do animal podem influenciar o escapamento observado no ensaio de Miles. Para minimizar o efeito dessas variáveis, pesquisadores devem usar littermates ou da mesma forma tamanho e envelhecido ratos como controles. Ao avaliar os mutantes do mouse para um determinado gene de interesse, os ratos devem ser gerados através um heterozigoto contra littermates estratégia e sua reprodução heterozigoto usados como controles. Além disso, é aconselhável a utilização de anestésicos de gás rapidamente reversível, tais como o isoflurano, para evitar a vasoconstrição, o que foi descrita por algumas drogas anestésicas administrada através de injeções parenterais24,25. A injeção de corante azul de Evans na veia lateral da cauda do rato é um passo crítico no presente protocolo e grandemente pode influenciar a qualidade da experiência e dados. Assim, pesquisadores devem ser competentes na realização de cauda veia injeções e irá provavelmente precisar de experiência prévia ou prática antes do início que do ensaio as milhas experimentar. Alternativamente, os investigadores poderiam usar outras vias intravenosa entregar Evans azul, tais como a injeção retro-orbital se eles são experientes com isso. Injeção intradérmica de permeabilidade-promover soluções podem causar danos agente independente à pele. Portanto, injecções intradérmicas não deve exceder 20 µ l de volume, devem sempre ser realizadas na presença do inibidor da histamina e normalizadas para injeções de controle do veículo.
O ensaio de Miles tem sido utilizado por muitos pesquisadores para avaliar os componentes da VEGF-A via de sinalização, por exemplo, porque a permeabilidade vascular VEGF A-induzida provoca ascite em pacientes de câncer16 e edema prejudicando a visão em vários neovascular doença de olho7. Assim, nós e os outros têm usado o ensaio de Miles para comparar o VEGF-A fuga de vascular induzida em ratos que foram geneticamente modificados para a falta de componentes específicos do VEGF-A sinalização cascata12,13,14, 15 , 20 , 23. nosso estudo recente usando esta abordagem revelou que a principal isoforma de VEGF-A patológica, VEGF165, os sinais através de um complexo de VEGFR2 e NRP1, em que o domínio citoplasmático NRP1 promove a ativação de ABL quinase-mediada de quinases família SRC para evocar uma resposta de hyperpermeability14. VEGFA também promove o crescimento de vasos sanguíneos e pode, portanto, ser utilizada terapeuticamente para restabelecer o fluxo sanguíneo para os tecidos isquêmicos, se suas atividades hyperpermeability podem ser especificamente inibidas. Investigação para elucidar o mecanismo molecular que orienta o VEGF-A respostas das células endoteliais vasculares no sentido hyperpermeability vascular pode, portanto, identificar caminhos que podem ser manipulados seletivamente para inibir o edema patológico induzido VEGF-A em doenças, como câncer ou doença isquêmica ocular. O ensaio de milhas, sem dúvida, vai continuar a ser um método útil para apoiar estes e muitos outros tipos de estudos funcionais para elucidar os reguladores moleculares e efetores de hyperpermeability vascular.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Laura Denti, Valentina Senatore e o pessoal da unidade de recursos biológicos no Instituto de Oftalmologia da UCL para ajuda com a criação de rato e Camille Charoy para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Medical Research Council (Sr/N011511/1) C. Ruhrberg e uma bolsa de estudo britânico PhD de fundação do coração de gelo J.T. (FS/13/59/30649).
Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml – 8 mm – 30G | BD | 324826 | |
Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Mouse restrainer | |||
Heat chamber | |||
Hair clippers | |||
Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
Scalpal | |||
Blunt scissor | |||
Forceps | |||
Eppendorf tubes | |||
Heatblock | |||
Cork board | |||
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |