एक पारिवारिक विटिलिगो मानव जिगर Chimeric माउस प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग कर मॉडल-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स
Summary
यहां, हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल का उपयोग कर विटिलिगो के एक मानव जिगर chimeric माउस मॉडल उत्पंन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-हेपैटोसाइट्स व्युत्पंन । यह विटिलिगो के लिए नए उपचारों के परीक्षण के लिए एक मूल्यवान मॉडल है ।
Abstract
पारिवारिक विटिलिगो (एफ एच) ज्यादातर कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR) उत्परिवर्तनों और परिणाम जल्दी शुरुआत हृदय रोग का एक बढ़ा जोखिम में एलडीएल कोलेस्ट्रॉल के चिह्नित उंनयन के कारण होता है (एलडीएल-सी) रक्त में । Statins विटिलिगो के एफ एच और अंय प्रकार के इलाज के लिए लिपिड कम दवाओं की पहली पंक्ति रहे हैं, लेकिन नए दृष्टिकोण विशेष रूप से PCSK9 एंटीबॉडी, जो अब नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया जा रहा है में उभर रहे हैं । एफ एच, या तो नई दवाओं या नए योगों के लिए उपंयास चिकित्सकीय दृष्टिकोण का पता लगाने के लिए, हम vivo मॉडल में उचित की जरूरत है । हालांकि, मानव की तुलना में लिपिड चयापचय प्रोफाइल में अंतर एफ एच के उपलब्ध पशु मॉडलों की एक प्रमुख समस्या है। इस समस्या को हल करने के लिए, हम एक मानव जिगर chimeric माउस मॉडल एफ एच प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) का उपयोग कर उत्पंन किया है-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स (iHeps) । हमने Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) चूहों के लिए प्रत्यारोपण मानव कोशिकाओं की प्रतिरक्षा अस्वीकृति से बचने के लिए और एक Ldlr नल पृष्ठभूमि में iHeps की कमी Ldlr के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया । ट्रांसप्लांटेशन एफ एच iHeps LRG माउस मानव एल्ब्युमिन धुंधला के आधार पर जिगर के 5-10% फिर से आबाद सकता है । इसके अलावा, engrafted iHeps लिपिड कम दवाओं और statins की तुलना में PCSK9 एंटीबॉडी की वृद्धि की प्रभावकारिता के नैदानिक टिप्पणियों recapitulated के लिए जवाब दिया । हमारे मानव जिगर chimeric मॉडल इस प्रकार एफ एच के लिए नए उपचारों के नैदानिक परीक्षण के लिए उपयोगी हो सकता है । एक ही प्रोटोकॉल, अंय एफ एच आनुवंशिक वेरिएंट, या अंय वंशानुगत जिगर के रोगों के लिए इसी उत्परिवर्तनों के लिए इसी तरह मानव जिगर chimeric चूहों का प्रयोग, भी उत्पंन किया जा सकता है ।
Introduction
कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR) रक्त में एलडीएल कोलेस्ट्रॉल (एलडीएल सी) कब्जा करने के लिए जिगर में कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण का नियमन । LDLR जीन में उत्परिवर्तनों पारिवारिक विटिलिगो (एफ एच)1के सबसे अक्सर कारण हैं । Statins पारंपरिक रूप से दवा की पहली पंक्ति के लिए एफ एच और विटिलिगो के अंय प्रकार के इलाज किया गया है (विरासत या अधिग्रहीत) । Statins बाधित 3-hydroxy-3-methylglutaryl-कोएंजाइम एक रिडक्टेस जिगर2में कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण को कम करने के लिए. इसके अतिरिक्त, statins hepatocyte सतह पर LDLR स्तर बढ़ाने के लिए प्लाज्मा एलडीएल सी निकासी को बढ़ावा देने के । हालांकि, statins के साथ उपचार के एक प्रमुख चेतावनी है कि वे एक साथ एक एंजाइम convertase subtilisin/hexin 9 (PCSK9) की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करता है, जो अपने क्षरण को बढ़ावा देने के लिए LDLR करने के लिए बाइंड कर देता है3. यह प्रभाव कई रोगियों में मनाया statins के लिए अपर्याप्त या यहां तक कि नल प्रतिक्रिया के लिए जिंमेदार है । इस तंत्र का अध्ययन, अप्रत्याशित रूप से, विटिलिगो के इलाज के लिए एक वैकल्पिक रास्ते की खोज के लिए नेतृत्व किया । PCSK9 एंटीबॉडी हाल ही में एफडीए द्वारा अनुमोदित वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में इस्तेमाल किया जा रहा है और उच्च प्रभावकारिता और4statins से बेहतर सहिष्णुता दिखाओ । PCSK9 एंटीबॉडी की सफलता से यह भी तात्पर्य है कि विटिलिगो के साथ रोगियों में LDLR ह्रास मार्ग (PCSK9 के अलावा) का नियमन करने के लिए अन्य चिकित्सीय संभावनाएं हो सकती हैं. इसी तरह, एंटीबॉडी के अलावा PCSK9 के नए अवरोधकों के विकास में रुचि है, उदाहरण के लिए, सिरना ओलिगोस्पर्मिया5.
एफ एच के लिए नए उपचारों और सामांय में विटिलिगो के किसी अंय प्रकार के परीक्षण के लिए, vivo मॉडल में उपयुक्त आवश्यक हैं । vivo मॉडल में वर्तमान की एक प्रमुख समस्या है, ज्यादातर चूहे6 और खरगोश7, मनुष्यों के साथ उनके शारीरिक मतभेद हैं । महत्वपूर्ण, इन समस्याओं का एक अलग लिपिड चयापचय प्रोफ़ाइल शामिल हैं । मानव जिगर chimeric जानवरों की पीढ़ी8 इस चेतावनी को दूर करने में मदद कर सकता है । मानव जिगर chimeric माउस का एक प्रकार है “मानव” माउस के साथ अपने जिगर मानव हेपैटोसाइट्स के साथ repopulateded, उदाहरण के लिए, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स (pHH)9. pHH के साथ एक समस्या यह है कि वे पूर्व vivoका विस्तार नहीं किया जा सकता है, जल्दी से अलगाव पर अपने समारोह खो, और एक सीमित स्रोत हैं । pHH के लिए एक विकल्प प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) का उपयोग है-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स (iHeps)10। विशेष रूप से, iPSCs रोगी-विशिष्ट हैं और अनिश्चित काल तक उगाया जा सकता है, इसलिए iHeps मांग पर उत्पादन किया जा सकता है, जो ताजा pHH पर एक महत्वपूर्ण लाभ है । इसके अलावा, iPSCs भी आसानी से आनुवंशिक रूप से डिजाइनर nucleases के साथ इंजीनियर को सही या एक isogenic पृष्ठभूमि में उत्परिवर्तनों परिचय कर सकते है और अधिक वफादार तुलना11अनुमति देते हैं ।
मानव जिगर chimeric माउस engrafted pHH के साथ जिगर चयापचय प्रोफाइल में मनुष्यों के लिए समानताएं दिखाने, दवा प्रतिक्रियाओं, और हेपेटाइटिस वायरस के संक्रमण के लिए संवेदनशीलता12. इससे उन्हें वीवो मेंhyperlipidemia का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल बना है । सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल माउस मॉडल फह-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (FRG) माउस13 और uPA ट्रांसजेनिक माउस8, जिसमें माउस जिगर के ९५% तक pHH द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है पर आधारित हैं । दिलचस्प है, हाल ही में एक रिपोर्ट एक मानव एफ एच जिगर chimeric माउस (FRG माउस के आधार पर) एक रोगी एक homozygous LDLR उत्परिवर्तन14ले जाने से pHH के साथ वर्णित है । इस मॉडल में, repopulateded मानव हेपैटोसाइट्स कोई कार्यात्मक LDLR था, लेकिन अवशिष्ट माउस हेपैटोसाइट्स किया था, इस प्रकार vivo LDLR मार्ग पर निर्भर दवाओं के परीक्षण में प्रदर्शन के लिए उपयोगिता को कम करने ।
यहां, हम Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) माउस जिगर में engrafting एफ एच iHeps के लिए हमारे हाल ही में प्रकाशित काम15 के आधार पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । इस मानव जिगर chimeric माउस एफ एच और vivo में दवा परीक्षण प्रदर्शन मॉडलिंग के लिए उपयोगी है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले iHeps कुतर में प्रयोग अध्ययन की पुष्टि की है कि वे एक प्रभावी तरीका है विरासत में मिली जिगर की बीमारियों का अध्ययन17। आगे इस प्रौद्योगिकी के उपयोग का विस्तार करने के लिए और क्योंकि वर्तमान ए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद के बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (JCYJ20150331142757383), चीनी विज्ञान अकादमी (XDA16030502) के सामरिक प्राथमिकता अनुसंधान कार्यक्रम, हांगकांग अनुसंधान अनुदान परिषद विषय आधारित अनुसंधान द्वारा समर्थित किया गया योजना (T12-705/11), हांगकांग विशेष प्रशासनिक क्षेत्र के अनुसंधान अनुदान परिषद के सहयोग कार्यक्रम और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एन-HKU730/गुआंग्डोंग प्राकृतिक विज्ञान की अनुसंधान टीम परियोजना) । फाउंडेशन (2014A030312001), गुआंगज़ौ विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (२०१६०७०१००८६), और गुआंग्डोंग प्रांत विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (2016B030229007 और 2017B050506007) ।
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
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