가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes
Summary
여기, 우리 현재 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 hepatocytes를 사용 하 여 가족성 콜레스테롤 혈 증의 인간 간 공상 마우스 모델을 생성 하는 프로토콜. 콜레스테롤 혈 증에 대 한 새로운 치료법을 테스트 하기 위한 유용한 모델입니다.
Abstract
가족성 콜레스테롤 혈 증 (FH) 대부분 저밀도 지 단백질 수용 체 (LDLR) 돌연변이 의해 발생 하 고 표시 된 혈액에 LDL 콜레스테롤 (LDL-콜레스테롤) 상승으로 인해 발병 초기 심혈 관 질환의 위험 증가에 결과. 스타 틴 FH와 다른 종류의 콜레스테롤 혈 증, 치료를 위한 지질 저하 약물의 첫 번째 줄만 지금은 임상 시험에서 테스트 되 고 특정 PCSK9 항 체에 새로운 접근 떠오르고 있다. FH, 신약 또는 새로운 공식에 대 한 새로운 치료 접근을 탐구 하 비보에 모델에 적절 한 필요 합니다. 그러나, 인 간에 비해 지질 대사 프로필에 차이 FH. 의 사용 가능한 동물 모델의 핵심 문제 우리 인간의 간 공상 마우스 모델 FH 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 사용 하 여이 문제를 해결 하려면 생성-파생 hepatocytes (iHeps). 이식된 인간 세포의 면역 거부를 방지 하 고 LDLR의 효과 평가/Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) 마우스를 사용 하는 우리-는 LDLR 결핍 iHeps null 배경. 이식된 FH iHeps 수 LRG 마우스 간 인간의 알 부 민 얼룩에 따라 5-10%를 다시 채웁니다. 또한, engrafted iHeps 지질 저하 약물에 반응 하 고 지 스타 틴에 비해 PCSK9 항 체의 증가 효능의 임상 관찰. 우리의 인간의 간 공상 모델 따라서 FH에 새로운 치료의 임상 테스트 하는 데 유용 수 있습니다. 다른 FH 유전 이체, 또는 다른 상속 된 간 질병에 해당 하는 돌연변이 대 한 동일한 프로토콜, 비슷한 인간의 간 공상 쥐를 사용 하 여 또한 생성 될 수 있습니다.
Introduction
저밀도 지 단백질 수용 체 (LDLR)는 간에 서 콜레스테롤 합성을 조절 하는 혈액에 LDL 콜레스테롤을 (LDL-콜레스테롤)을 캡처합니다. LDLR 유전자에 있는 돌연변이 가족성 콜레스테롤 혈 증 (FH)1의 가장 빈번한 원인이 됩니다. 스타 틴 FH와 다른 유형의 상속 (인수) 콜레스테롤 혈 증을 치료 하는 약물의 첫 번째 줄 전통적으로 있다. 스타 틴 3-히 드 록 시-3-methylglutaryl-코엔자임 reductase 낮은 간2에서 콜레스테롤 합성을 억제 합니다. 또한, 스타 틴 혈장 LDL-C 클리어런스를 홍보 hepatocyte 표면에 LDLR 수준을 높일. 그러나, 스타 틴 치료의 주요 경고는 그들은 동시에 proprotein convertase subtilisin/9 (PCSK9), 그것의 저하3홍보 LDLR 바인딩하는 효소 hexin의 표현을 유도. 이 효과 많은 환자에서 스타 틴을 부족 하거나 심지어 null 응답에 대 한 책임. 이 메커니즘을 공부 예기치 않게, 콜레스테롤 혈 증을 치료 하는 대체 방법의 발견으로 이끌어 냈다. PCSK9 항 체 최근 FDA에 의해 승인 임상 시험에서 현재 사용 되 고 높은 효능과 스타 틴4보다 더 나은 향상을 보여. PCSK9 항 체의 성공 또한 콜레스테롤 혈 증 환자에서 (외 PCSK9) LDLR 저하 통로 조절 하는 다른 치료 가능성 있을 수 있음을 의미 합니다. 마찬가지로, 항 체, 예, siRNA oligos5이외의 새로운 PCSK9 억제제 개발에 관심이 있다.
FH 고 콜레스테롤 혈 증의 일반적 다른 형식에 대 한 새로운 치료를 테스트 하려면 적절 한 비보에 모델은 필요 합니다. 현재 생체 내에서 주요 문제 모델, 대부분 마우스6 및7, 토끼는 인간과 그들의 생리 적인 차이. 결정적으로,이 문제는 다른 지질 대사 프로필을 포함 됩니다. 인간의 간 공상 동물8 세대는이 경고를 극복 하는 데 도움이 있습니다. 인간의 간 공상 마우스의 간 인간의 hepatocytes, 예를 들어 기본 인간의 hepatocytes (pHH)9로 다시 채울 “인간 답게” 마우스의 유형입니다. PHH와 문제는 그들이 신속 하 게 확장 된 전 비보, 수 없습니다 격리에 그들의 기능을 잃게 하 고 제한 된 소스. PHH에 대안은 이다 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 사용 하 여-파생 hepatocytes (iHeps)10. 특히, Ipsc 환자 전용 이며 iHeps은 상당한 이점을 신선한 pHH 주문형 생산 될 수 있도록 무기한, 성장 될 수 있다. 또한, Ipsc 수 있습니다 또한 쉽게 유전자 설계 될 디자이너 nucleases 수정 하거나 더 충실 한 비교11수 있도록 isogenic 배경에서 돌연변이 소개와 함께.
Engrafted pHH와 인간의 간 공상 마우스 간 대사 프로필, 약물 반응, 간염 바이러스 감염12민감성에 인 간에 게 유사점을 보여줍니다. 이로써 그들 혈에서 vivo에서공부 하기 좋은 모델. 가장 널리 사용 되는 마우스 모델/파-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (FRG) 마우스13 와 uPA 유전자 변형 마우스8, 마우스의 95%는 최대에 간 pHH에 의해 대체 될 수를 기반으로 합니다. 흥미롭게도, 최근 보고서는 인간의 간 FH 공상 마우스 (독일 연방 공화국 마우스에 따라) pHH homozygous LDLR 돌연변이14들고 환자에서 설명 합니다. 이 모델에서 repopulated 인간의 hepatocytes 했다 아무 기능 LDLR 했지만 잔여 마우스 hepatocytes, 따라서 vivo에서 LDLR 경로에 의존 하는 약물의 테스트를 수행 하기 위한 유틸리티를 감소.
여기, 우리 보고 상세한 프로토콜을 우리의 최근에 출판 된 작품 15/Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) 마우스 간으로 FH iHeps를 engrafting에 기반으로 합니다. 이 인간의 간 공상 마우스는 FH를 모델링 및 약물 테스트를 수행 하는 데 유용 vivo에서.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 연구에서 설치류 iHeps를 사용 하 여 상속 된 간 질환17를 공부 하는 효과적인 방법 다는 것을 확인 했습니다. 추가 하려면이 기술 사용 하 여 확장 하 고 현재 FH 동물 모델 차선 때문에, 우리 LRG 쥐로 FH iHeps engrafted engrafted LDLR + 또는 heterozygous LDLR보여주었다-돌연변이 FH iHeps 쥐 플라스마 LDL-콜레스테롤 수준을 줄일 수 있습니다 그리고 응답 지질 저하 약물 vivo?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 심천 과학 및 기술 위원회 기본 연구 프로그램 (JCYJ20150331142757383), 홍콩 연구 보조금 위원회 테마 기반 연구 (XDA16030502), 과학의 중국 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 체계 (T12-705/11), 홍콩 특별 행정구의 연구 보조금 위원회 및 중국 (N-HKU730/12 81261160506), 연구 팀 프로젝트의 광 동 자연 과학의 국립 자연 과학 재단의 협력 프로그램 재단 (2014A030312001), 광주 과학 및 기술 프로그램 (201607010086), 그리고 광 동성 과학 및 기술 프로그램 (2016B030229007 및 2017B050506007)
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
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