Een familiale hypercholesterolemie menselijke lever chimeer muismodel met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een menselijke lever chimeer muismodel van familiale hypercholesterolemie met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten. Dit is een waardevol model voor het testen van nieuwe therapieën voor hypercholesterolemie.
Abstract
Familiale hypercholesterolemie (FH) wordt meestal veroorzaakt door mutaties van low-density lipoprotein receptor (LDLR) en resulteert in een verhoogd risico op hart-en vaatziekten van early-onset als gevolg van de aanzienlijke verhoging van LDL cholesterol (LDL-C) in het bloed. Statines zijn de eerste regel van lipide-verlagende medicijnen voor de behandeling van FH en andere soorten hypercholesterolemie, maar nieuwe benaderingen zijn in opkomst, in bepaalde PCSK9 antilichamen, die nu zijn getest in klinische proeven. Voor het verkennen van nieuwe therapeutische benaderingen voor FH, nieuwe geneesmiddelen of nieuwe formuleringen, moeten we in vivo modellen nodig. Verschillen in de metabole lipidenprofielen vergeleken bij de mens zijn een kernprobleem van de beschikbare dierlijke modellen van FH. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een muismodel van de menselijke lever chimeer met behulp van FH geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) gegenereerd-afgeleid van hepatocyten (iHeps). We gebruikten/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) muizen te vermijden immuun afwijzing van getransplanteerde menselijke cellen en te beoordelen van het effect van LDLR-deficiënte iHeps in een LDLR null achtergrond. Getransplanteerde FH iHeps kon weer toevoegen aan 5-10% van de IRG muis lever gebaseerd op menselijke albumine kleuring. Bovendien, het werk iHeps gereageerd op lipide-verlagende medicijnen en klinische waarnemingen van verhoogde efficiëntie van PCSK9 antilichamen t.o.v. statines gerecapituleerd. Onze menselijke lever chimeer model kan dus nuttig zijn voor preklinische testen van nieuwe therapieën voor FH. Met behulp van de hetzelfde protocol, soortgelijke menselijke lever chimeer muizen voor andere FH genetische varianten of overeenkomt met andere erfelijke lever ziekten, mutaties kan ook worden gegenereerd.
Introduction
Low-density lipoprotein receptor (LDLR) vangt LDL-cholesterol (LDL-C) in het bloed naar het moduleren van de synthese van cholesterol in de lever. Mutaties in het gen LDLR zijn de meest voorkomende oorzaak van familiale hypercholesterolemie (FH)1. Statines zijn traditioneel de eerste regel van medicatie voor de behandeling van FH en andere soorten hypercholesterolemie (geërfd of verworven). Statines remmen 3-hydroxy-3-methylglutaryl-co-enzym een reductase te verlagen van de synthese van cholesterol in de lever2. Bovendien, verhogen statines LDLR op het oppervlak van de hepatocyte ter bevordering van plasma LDL-C klaring. Een belangrijke caveat van behandeling met statines is echter dat ze gelijktijdig de expressie van het proprotein convertase subtilisin/hexin 9 (PCSK9), een enzym dat zich aan LDLR bindt te bevorderen de afbraak3induceren. Dit effect is verantwoordelijk voor de onvoldoende of zelfs null reactie op statines bij veel patiënten waargenomen. Bestuderen van dit mechanisme heeft onverwacht, geleid tot de ontdekking van een alternatieve manier voor de behandeling van hypercholesterolemie. PCSK9 antilichamen onlangs goedgekeurd door de FDA worden momenteel gebruikt in klinische proeven en Toon grotere werkzaamheid en betere tolerantie dan statines4. Het succes van PCSK9 antilichamen houdt ook in dat er mogelijk andere therapeutische mogelijkheden aan het moduleren van het traject van de LDLR-degradatie (behalve PCSK9) bij patiënten met hypercholesterolemie. Ook is er belang bij de ontwikkeling van nieuwe remmers van PCSK9 dan antilichamen, bijvoorbeeld, siRNA oligos5.
Als u wilt testen van nieuwe therapieën voor FH en in het algemeen een andere soort hypercholesterolemie, zijn passende in vivo modellen nodig. Een groot probleem van de huidige in-vivo modellen, meestal muizen6 en7, konijnen hun fysiologische verschillen met de mens. Deze problemen omvatten is cruciaal, een verschillende lipide metabole profiel. De generatie van menselijke lever chimeer dieren8 kan helpen overwinnen van deze waarschuwing. De menselijke lever Chimeer muis is een soort “gehumaniseerd” muis met haar lever opnieuw gevuld met menselijke hepatocyten, bijvoorbeeld primaire menselijke hepatocyten (pHH)9. Een probleem met pHH is dat ze niet kunnen uitgevouwen ex vivo, snel worden verliezen hun functie op isolatie, en een beperkte bron. Een alternatief voor pHH is het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleid van hepatocyten (iHeps)10. Met name iPSCs patiënt-specifiek zijn en kunnen worden gekweekt voor onbepaalde tijd, zodat iHeps kunnen worden geproduceerd op vraag, die een aanzienlijk voordeel ten opzichte van verse pHH. Bovendien, iPSCs kan ook worden gemakkelijk genetisch gemanipuleerde met designer nucleasen te corrigeren of mutaties in een isogene achtergrond om meer trouw vergelijkingen11te voeren.
Menselijke lever Chimeer muis met werk pHH vertonen overeenkomsten op de mens in de lever metabool profielen, drug reacties en gevoeligheid voor hepatitis virus infectie12. Dit maakt ze een goed model te bestuderen hyperlipidemie in vivo. De meest gebruikte Muismodellen zijn gebaseerd op de/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (FRG) muis13 en de uPA transgene muis8, welke tot 95% van de muis lever door pHH vervangen kan. Interessant, beschreven een recent rapport een menselijke FH lever Chimeer muis (gebaseerd op de muis FRG) met pHH uit een patiënt een homozygoot LDLR mutatie14uitvoering. In dit model, de nieuwe menselijke hepatocyten had geen functionele LDLR, maar de resterende muis hepatocyten deed, waardoor het hulpprogramma voor het uitvoeren van de in vivo tests van drugs afhankelijk van de LDLR-pathway.
Wij rapporteren hier een gedetailleerde protocol is gebaseerd op onze onlangs gepubliceerde werk15 voor enten FH iHeps in de/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) muis lever. Deze menselijke lever Chimeer muis is handig voor het modelleren van FH en uitvoeren van de drug testen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere studies met behulp van iHeps in knaagdieren hebben bevestigd dat zij een effectieve manier zijn om het studeren overgenomen leverziekten17. Verder uitbreiden van het gebruik van deze technologie omdat huidige FH diermodellen suboptimaal zijn, wij en FH iHeps geaccepteerd in LRG muizen is gebleken dat het werk LDLR +/- of heterozygoot LDLR-gemuteerde FH iHeps muizen plasma LDL-C niveau kan verminderen en reageren op het lipide-verlagende drugs in vivo.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het Shenzhen wetenschap en technologie Raad Basic Research Program (JCYJ20150331142757383), strategische prioriteit Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDA16030502), Hong Kong onderzoek subsidie Raad thema gebaseerd onderzoek Regeling (T12-705/11), samenwerking programma van de Onderzoeksraad van de subsidies van de speciale administratieve regio van Hongkong en de nationale natuurlijke Science Foundation van China (N-HKU730/12 en 81261160506), Team onderzoeksproject van Guangdong natuurwetenschappen Stichting (2014A030312001), Guangzhou Science en technologie programma (201607010086), en de provincie Guangdong Science and Technology Program (2016B030229007 en 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
