استخدام الموجات فوق الصوتية تسترشد الأنسجة الموجهة غرس الخلوية لإنشاء تكثيفها الورم المنتشر بيولوجيا ذات الصلة
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول استخدام حقن نيوروبلاستوما (ملحوظة) والخلايا ساركومه (ES) يوينغ الموجهة بالموجات فوق الصوتية (إنشاء خطوط الخلايا والخلايا السرطانية المستمدة من المريض) في المواقع ذات الصلة بيولوجيا لإنشاء نماذج موثوقة السريرية للسرطان البحث.
Abstract
التجارب الإكلينيكية لعلاجات السرطان يعتمد على نماذج xenograft ذات الصلة التي تحاكي ميول فطرية للسرطان. وتشمل مزايا النماذج القياسية الجناح تحت الجلد سهولة إجرائية، والقدرة على رصد تطور الورم والاستجابة دون تصوير الغازية. هذه النماذج غالباً ما تكون غير متناسقة في التجارب السريرية متعدية الجنسيات ومحدودة من الخصائص ذات الصلة بيولوجيا مع نزوع منخفضة لإنتاج ورم خبيث، كما أن هناك نقص المكروية الأصلي. وبالمقارنة، أظهرت نماذج إكسينوجرافت أورثوتوبيك في مواقع الورم الأصلي إلى تقليد وورم المكروية وتكرار خصائص الأمراض الهامة مثل انتشار المنتشر بعيد المنال. غالباً ما تتطلب هذه النماذج مملة العمليات الجراحية مع فترات طويلة من الزمن والإنعاش مخدر. ولمعالجة ذلك، استخدمت الباحثين السرطان مؤخرا تقنيات الحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية سرطان إكسينوجرافت وضع نماذج للتجارب الإكلينيكية، والتي تسمح بإنشاء نماذج مورين الموجه من الأنسجة سريعة وموثوق بها. التصوير بالموجات فوق الصوتية كما يوفر أسلوب موسع لتقييم طولية للورم انجرافتمينت والنمو. هنا، نحن تصف طريقة الحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية للخلايا السرطانية، استخدام الغدة الكظرية ملحوظة وكبسولة شبه الكلي لوفاق. هذا النهج كسبها يتغلب على الجراحة المفتوحة مملة زرع الخلايا السرطانية في المواقع الخاصة بالانسجة للنمو وورم خبيث، ويوقف فترات الانتعاش المهووسين. يصف لنا الاستفادة من خطوط الخلايا المحددة وخطوط الخلايا المشتقة المرضى لحقن أورثوتوبيك. تتوفر مجموعات تجارية مسبقة الصنع للانفصال من ورم ووضع علامات لوسيفراس من الخلايا. حقن تعليق خلية باستخدام الصورة-التوجيه يوفر منبرا الحد الأدنى الغازية واستنساخه لإنشاء نماذج الإكلينيكية. ويستخدم هذا الأسلوب لإنشاء نماذج موثوقة السريرية لسرطانات أخرى مثل المثانة والكبد والبنكرياس تجسد إمكانات لم تستغل بعد للعديد من النماذج السرطان.
Introduction
نماذج xenograft الحيوانية أدوات أساسية للدراسات الإكلينيكية لرواية علاجات السرطان. تكثيفها موريني القياسية تعتمد على غرس الجناح تحت الجلد من الخلايا، وتزويد موقع كفاءة ويمكن الوصول إليها بسهولة لرصد نمو الورم. العيب نماذج تحت الجلد هو افتقارها إلى الخصائص البيولوجية الخاصة بالأورام، التي قد تحد من إمكاناتها السرطاني1. يتم التغلب على هذه القيود باستخدام أورثوتوبيك تكثيفها في أي ورم الخلايا هي انجرافتيد في مواقع النسيج الأصلي، وتزويد المكروية ذات صلة المحتملة النقيلي2. نماذج إكسينوجرافت أورثوتوبيك الحفاظ على السمات البيولوجية الأصلية، وتوفير نماذج موثوقة لاكتشاف العقاقير السريري3،4. الخلايا السرطانية تستخدم لزرع الأنسجة الموجهة هي خطوط الخلايا المحددة أو خلايا المريض-مشتقة من أورام المرضى. قد يحمل تكثيفها المنشأة من خطوط خلايا السرطان عالية التباين الوراثية من الورم الرئيسي مقارنة بتكثيفها المشتقة المريض5. ونظرا لهذا، أصبح إنشاء تكثيفها أورثوتوبيك المستمدة من المريض المعيار المفضل لاختبار علاجات جديدة في اكتشاف الأدوية السرطان.
في نيوروبلاستوما السرطان طب الأطفال (ملحوظة)، نماذج إكسينوجرافت أورثوتوبيك الخص البيولوجيا الورم الرئيسي، وتطوير ورم خبيث لمواقع نموذجية لملاحظة: نشر6،7. ملحوظة: يطور في الغدة الكظرية أو على طول سلسلة متعاطفة مع مجاورة. الأساليب الأكثر شيوعاً لزرع أورثوتوبيك تتطلب فتح البطن عبر العمليات الجراحية. هذه الأساليب غالباً ما تكون شاقة، والأمراض الحيوانية عالية، وفترات الانتعاش المعقدة. وقد استخدمت الاستبانة بالموجات فوق الصوتية مؤخرا لزرع الأنسجة الموجهة للخلايا السرطانية في تطوير عدة نماذج مورين لبحوث السرطان8،9. هذا الأسلوب موثوق بها، واستنساخه، فعالة وآمنة لإقامة الصلة الورم المنتشر تكثيفها10،11.
إنشاء تكثيفها طب السرطان بهدف الاسترشاد بالموجات فوق الصوتية الجهاز التعريب وابرة زرع خطوط الخلايا والخلايا السرطانية المستمدة من المريض هو أظهر11. واستخدمت التقنية لملاحظة موجهة إلى الغدة الكظرية مورين. ساركومه يوينغ في (ES) في الغالب سرطان العظمى، ينظر عادة في العظام الطويلة مثل عظمة الفخذ وعظام الحوض12. وقد أظهرت تقارير حالة أن تحديد ما إذا كان نمو السرطان العظمى الغالب عمليا في الأنسجة الكلوية، اختير موقع الحافظة شبه الكلي ل غرس أورثوتوبيك13. وقد استخدمت sub الكلوي الخلية الحافظة زرع الخلايا السرطانية كنموذج واعدة لدراسة الانبثاث العفوية لوفاق14.
Protocol
Representative Results
Discussion
زرع خلايا ملحوظة ووفاق الموجهة بالموجات فوق الصوتية وسيلة فعالة وآمنة لإثبات موثوقية تكثيفها مورين للدراسات الإكلينيكية في بيولوجيا السرطان. حاسمة بالنسبة لنجاح الموجهة بالموجات فوق الصوتية هو زرع الأنسجة المستهدفة بوجود وتوافر الموظفين المدربين ذوي الخبرة في تشريحيا إضفاء الطابع الم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقي هذا العمل الدعم من روبرت الخشب جونسون مؤسسة/آموس كلية تطوير البرنامج، توبمان معهد الأبحاث الطبية، وقسم جراحة الأطفال، جامعة ميتشجان. الكتاب أود أن أشكر كيمبر كونفيرسو-باران والدكتور ماركوس جربو للمساعدة مع إجراءات الحقن بالموجات فوق الصوتية ومنصة التصوير. ونشكر ترومبليي بول لمساعدته مع رسومات الشكل. ونشكر أيضا قسم الأشعة في “جامعة ميتشجان” لاستخدام مركز للتصوير الجزيئي والورم التصوير الأساسية، التي تدعمها جزئيا “مركز السرطان الشامل المعاهد الوطنية للصحة”، منح P30 CA046592. جامعة “ميشيغان فسيولوجيا Phenotyping الأساسية” معتمدة جزئيا بتمويل من منحة من المعهد الوطني للصحة (OD016502) ومركز القلب والأوعية الدموية فرانكل. تم مصادقة خط الخلية في “مرافق البحوث راديل إيديكسكس”، كولومبيا، ميزوري ونحن نشكر ستول تامي والدكتور راجين مودي وبرنامج علم الأورام الأورام الصلبة موت. لدينا المرضى والأسر العرفان للإلهام، وشجاعتهم، والدعم المستمر لابحاثنا.
Materials
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
