Utilização do ultra-som guiado implantação celular tecido-dirigido para o estabelecimento de Xenografts biologicamente relevantes Tumor metastático
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo utilizar injeção guiada por ultra-som de neuroblastoma (NB) e células (ES) de sarcoma de Ewing (estabeleceu linhas celulares e células tumorais do paciente-derivado) biologicamente relevantes locais para criar modelos pré-clínicos confiáveis para câncer pesquisa.
Abstract
Testes pré-clínicos de terapias anticâncer baseia-se em modelos de xenoenxertos relevantes que imitam as tendências inatas de câncer. Vantagens dos modelos padrão flanco subcutânea incluem facilidade processual e a capacidade de resposta sem imagens invasivas e progressão do tumor do monitor. Tais modelos são muitas vezes inconsistentes em ensaios clínicos translacionais e limitaram características biologicamente relevantes com baixa propensão para produzir metástase, como há uma falta de um microambiente nativo. Em comparação, modelos de transplante ortotópico em localizações tumorais nativos foram mostrados para imitar o microambiente do tumor e replicar características importantes doenças tais como a propagação metastática distante. Estes modelos geralmente exigem procedimentos cirúrgicos tediosos com períodos prolongados de tempo e recuperação anestésicos. Para resolver isso, pesquisadores de câncer recentemente tem utilizado técnicas de injeção guiada por ultra-som para estabelecer modelos de enxerto heterólogo câncer para experimentos pré-clínicos, que permite a criação rápida e fiável de modelos murino tecido-dirigido. Visualização de ultra-som também fornece um método não invasivo para avaliação longitudinal da enxertia de tumor e crescimento. Aqui, descrevemos o método de injeção guiada por ultra-som de células de câncer, utilizando a glândula adrenal para NB e cápsula renal sub para ES. Esta abordagem minimamente invasiva supera a implantação de cirurgia aberta tedioso de células cancerosas em locais específicos do tecido para o crescimento e a metástase e períodos de recuperação mórbida de abates. Descrevemos a utilização de linhagens celulares estabelecidas e de linhas de células derivadas paciente ortotópico injectável. Pre-feitos jogos comerciais estão disponíveis para dissociação de tumor e de luciferase marcação de células. Injeção da suspensão de células usando imagem-orientação fornece uma plataforma minimamente invasiva e pode ser reproduzida para a criação de modelos pré-clínicos. Este método é utilizado para criar modelos pré-clínicos confiáveis para outros tipos de câncer como bexiga, fígado e pâncreas, exemplificando seu potencial inexplorado de numerosos modelos de câncer.
Introduction
Modelos animais xenoenxertos são ferramentas essenciais para estudos pré-clínicos de romance terapias anticâncer. Xenografts murino padrão dependem de implantação subcutânea de flanco das células, fornecendo um local facilmente acessível e eficiente para monitorar o crescimento do tumor. A desvantagem dos modelos subcutâneos é a falta de características biológicas específicas do tumor, que pode limitar seu potencial de metástase1. Tais limitações são superadas pelo uso de xenografts ortotópico no qual tumor células estão incorporadas nos sítios de tecidos nativos, proporcionando um microambiente relevante com potencial metastático2. Modelos de transplante ortotópico mantêm características biológicas originais e fornecem modelos de confiança para descoberta de drogas pré-clínicos3,4. As células cancerosas utilizadas para implantação de tecido-dirigido são linhagens celulares estabelecidas ou paciente-derivado de células de tumores de pacientes. Xenografts estabelecidos de linhas de células de câncer podem apresentar alta divergência genética do tumor primário em relação ao paciente xenografts derivada5. Diante disso, o estabelecimento de paciente-derivado ortotópico xenografts tornou-se o padrão preferencial para teste novela terapêutica na descoberta da droga de cancro.
No neuroblastoma de câncer pediátrico (NB), modelos de transplante ortotópico recapitular a biologia do tumor primário em desenvolvem metástases para locais típicos de NB espalhar6,7. NB se desenvolve na glândula adrenal ou ao longo da cadeia simpática paravertebral. Os métodos mais comuns de implantação ortotópico requerem procedimentos cirúrgicos trans-abdominal abertos. Tais métodos são muitas vezes tediosos, têm alta taxa de mortalidade animal e períodos de recuperação complexa. Ultra-som de alta resolução tem sido recentemente utilizada para tecido-dirigido a implantação de células tumorais no desenvolvimento de vários modelos de murino para câncer pesquisa8,9. A técnica é confiável, pode ser reproduzido, eficiente e segura para o estabelecimento de tumor metastático relevantes xenografts10,11.
O estabelecimento de xenografts câncer pediátrico por alvo guiada por ultra-som órgão localização e agulha implantação de linhas de células e células tumorais do paciente-derivado é demonstrada11. A técnica foi utilizada para NB direcionado para a glândula adrenal murino. Sarcoma de Ewing (ES) é predominantemente um câncer ósseo, comumente visto em ossos longos como fêmur e ossos pélvicos12. Relatos de casos têm demonstrado que, para determinar se o crescimento de um câncer ósseo predominantemente é viável no tecido renal, uma localização capsular sub renal foi escolhida para ortotópico implantação13. Implantação de célula capsular sub renal de células do tumor tem sido utilizada como um modelo promissor para estudar metástases espontâneas para ES14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Guiada por ultra-som de implantação de células NB e ES é um método eficiente e seguro para estabelecer confiança xenografts murino para estudos pré-clínicos em biologia do câncer. Críticos para o sucesso de guiada por ultra-som implantação de tecido-alvo é a presença e a disponibilidade de pessoal treinado com conhecimentos especializados em localizar anatomicamente o órgão de interesse e na injeção estereotáxica de células tumorais.
A dissociação do tecido do tumor provo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho recebeu apoio a Robert Wood Johnson Foundation/Amos faculdade desenvolvimento programa, Taubman Instituto de investigação médica e a seção de cirurgia pediátrica, a Universidade de Michigan. Os autores desejam agradecer a Kimber iniciantes-Borges e Dr. Marcus Jarboe para a assistência com procedimentos de injeção de ultra-som e a plataforma de imagem. Agradecemos a Paul Trombley por sua ajuda com os gráficos da figura. Agradecemos também o departamento de Radiologia da Universidade de Michigan para a utilização do centro de imagem Molecular e o núcleo do Tumor Imaging, sustentados em parte por abrangente Cancer Center NIH, conceda P30 CA046592. A Universidade de Michigan fisiologia fenotipagem Core que é suportado em parte pela concessão de financiamento do NIH (OD016502) e do centro do sistema circulatório de Frankel. Autenticação de linha celular foi feita em instalações de bio-investigação IDEXX RADIL, Columbia, MO. Agradecemos a Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody e o programa de Oncologia Tumor sólido Mott. Nossos pacientes e familiares com gratidão são reconhecidos por sua inspiração, coragem e apoio permanente da nossa pesquisa.
Materials
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
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