ניצול של אולטרסאונד מודרכת מכוון רקמות השרשה הסלולר להקמתה של גידול גרורתי רלוונטי מבחינה ביולוגית Xenografts
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנצל מונחה אולטרה סאונד הזרקה של נוירובלסטומה (NB) ותאים של יואינג סרקומה (ES) (שהוקמה שורות תאים ותאים סרטניים נגזר החולה) באתרים הרלוונטיים ביולוגית ליצירת במודלים פרה אמין עבור סרטן מחקר.
Abstract
בדיקה פרה של טיפולים נגד סרטן מסתמכת על מודלים xenograft רלוונטי המחקים את נטיות מולדת של סרטן. היתרונות של דגמים סטנדרטיים האגף תת עורית כוללות הקלות פרוצדוראליות ואת היכולת התקדמות הגידול צג, התגובה ללא פולשני הדמיה. מודלים כאלה לעיתים קרובות אינם עקביים בניסויים קליניים translational, יש מוגבל המאפיינים הרלוונטיים ביולוגית עם נטייה נמוכה כדי לייצר גרורות, כפי שיש מחסור microenvironment מקורי. לשם השוואה, orthotopic דגמים xenograft באתרי גידול יליד הראו לחקות את microenvironment הגידול ואף לשכפל את מאפייני המחלה חשוב כגון התפשטות גרורתית מרוחקת. מודלים אלה דורשות לעתים קרובות ניתוחים מייגע עם תקופות זמן ושחזור הרדמה ממושכות. כדי לטפל בבעיה זו, סרטן חוקרים נעזרו לאחרונה הזרקת מונחה אולטרה סאונד טכניקות כדי ליצור מודלים xenograft סרטן לניסויים פרה, המאפשר הקמת מודלים מאתר מכוון רקמות מהיר ואמין. הדמיית אולטרה סאונד מספק גם שיטה לא פולשנית להערכת האורך של engraftment גידול וצמיחה. כאן, נתאר את שיטת להזרקה מונחה אולטרה סאונד של תאים סרטניים, ניצול בלוטת יותרת הכליה עבור NB ו- sub כליות כמוסה עבור ES. בגישה פולשנית זו גוברת על ניתוח פתוח מייגע ההשתלה של תאים סרטניים במיקומים רקמות ספציפיות עבור הצמיחה, גרורות, abates ותקופות התאוששות חולנית. אנו מתארים את הניצול של שורות תאים הוקמה והן שורות תאים נגזר החולה להזרקה orthotopic. ערכות מוכנות מראש מסחריים זמינים עבור גידול דיסוציאציה ותיוג לוציפראז של תאים. הזרקה של הבולם התא באמצעות תמונה-ההדרכה מספק פלטפורמה מינימלית פולשנית, לשחזור להקמת במודלים פרה. שיטה זו מנוצל ליצירת במודלים פרה אמין עבור סוגי סרטן אחרים כגון שלפוחית השתן, המשמשים שלה פוטנציאל לא ממומש עבור מודלים רבים של סרטן הכבד והלבלב.
Introduction
מודלים xenograft בעלי חיים הם כלי חיוני עבור מחקרים פרה של טיפולים נגד סרטן. Xenografts מאתר סטנדרטי להסתמך על האגף תת עורית ההשתלה של תאים, מתן אתר נגיש ויעיל עבור ניטור הגידול. החיסרון של מודלים תת עורית הוא היעדרם של מאפייני וחיסונים גידול ספציפי, אשר עשוי להגביל את הפוטנציאל שלהן גרורות1. הגבלות יש להתגבר על ידי שימוש xenografts orthotopic ב איזה גידול התאים הם engrafted באתרים רקמה מקורית, מתן של microenvironment רלוונטי עם פוטנציאל גרורתי2. מודלים xenograft Orthotopic לשמור על תכונות ביולוגיות המקורי ולספק מודלים אמינים סמים פרה-גילוי-3,–4. התאים הסרטניים מנוצל להשתלה רקמות מכוון הם שורות תאים הוקמה או תאים החולה נגזר מן המטופל גידולים. Xenografts הוקמה מתוך שורות תאים סרטן עשוי להפגין סטייה גנטית גבוהה מן הגידול העיקרי לעומת xenografts נגזר החולה5. נתון זה, הקמת xenografts orthotopic נגזר החולה הפך תקן המועדפת לבדיקת הריפוי בגילוי סרטן סמים.
סרטן ילדים נוירובלסטומה (NB), מודלים xenograft orthotopic מסכם את הדברים הגידול העיקרי ביולוגיה, לפתח גרורות לאתרים טיפוסי של NB להפיץ6,7. NB מתפתח בבלוטת יותרת הכליה או לאורך השרשרת סימפטי הבין-חולייתיים. השיטות הנפוצות ביותר של orthotopic-השרשה מחייבים הליכים כירורגיים הטרנס-בטן פתוחה. שיטות כאלה לעיתים מייגע, יש תחלואה גבוהה בעלי חיים, ותקופות התאוששות מורכבים. אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יש לאחרונה נעזרו מכוון רקמות ההשתלה של תאים סרטניים בשלבי פיתוח של מספר מודלים מאתר סרטן מחקר8,9. הטכניקה היא אמין לשחזור, יעיל, בטוח להקמתה של גידול גרורתי הרלוונטיים xenografts10,11.
הקמת סרטן ילדים xenografts על ידי המטרה מונחה אולטרסאונד איברים ההשתלה לוקליזציה ואת המחט של שורות תאים ותאים סרטניים נגזר החולה הוא והפגינו11. הטכניקה היה מנוצל עבור NB ממוקד בלוטת יותרת הכליה מאתר. סרקומה ע ש יואינג (ES) היא בעיקר סרטן osseous, לעתים קרובות העצמות הארוכות כמו עצם הירך ו עצמות האגן12. הדו חות הראו כי כדי לקבוע אם הצמיחה של סרטן בעיקר osseous ריאלי ברקמת הכליה, במיקום הסיבה sub כליות נבחרה עבור orthotopic-השרשה13. יש כבר מנוצל כליות תת תא הסיבה ההשתלה של תאים סרטניים כמודל מבטיח ללמוד גרורות ספונטנית ES14.
Protocol
Representative Results
Discussion
מונחה אולטרה סאונד ההשתלה של תאים NB ו- ES היא שיטה יעילה ובטוחה להקים אמין xenografts מאתר ללימודי פרה בביולוגיה סרטן. קריטי להצלחת מונחה אולטרה סאונד ממוקדות רקמות השרשה הוא הנוכחות ואת הזמינות של צוות מיומן עם מומחיות אנטומית לאתר. את האיבר של עניין, הזרקת סטיאוטטי של תאים סרטניים.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו קיבלה תמיכה את רוברט ווד ג’ונסון קרן/עמוס סגל פיתוח תוכנית, טאובמן מכון המחקר הרפואי, ואת סעיף של כירורגיה ילדים, אוניברסיטת מישיגן. המחברים רוצים להודות קימבר והלקסיקוגרפיה-ברן וד ר מרקוס Jarboe עבור הסיוע בהליכים הזרקת אולטרסאונד ולמערכת הדמיה. אנו מודים פול טראמבלי לסיוע שלו עם איור גרפיקה. אנו מודים גם את מחלקת רדיולוגיה ב אוניברסיטת מישיגן לשימוש של המרכז הדמיה מולקולרית והליבה הגידול הדמיה, אשר נתמכים חלקית על ידי מקיף סרטן מרכז NIH, להעניק P30 CA046592. האוניברסיטה של מישיגן פיזיולוגיה Phenotyping ליבה נתמך בחלקו על ידי מענק למימון NIH (OD016502) ואל מרכז לב וכלי דם פרנקל. תא קו אימות נעשתה במתקני Bioresearch RADIL IDEXX, קולומביה אנו מודים סטול תמי, ד ר Rajen Mody, התוכנית אונקולוגיה מוט גידול מוצק. חולים ומשפחות שלנו בתודה הודה שלהם השראה, אומץ, ותמיכה שוטפת של המחקר שלנו.
Materials
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
