Användningen av ultraljud guidade vävnad-regisserad cellulära Implantation för etableringen av biologiskt relevanta metastaserande tumör xenograft
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att använda ultraljud-guidad injektion av neuroblastom (NB) och Ewings sarkom (ES) celler (etablerade cellinjer och patientderiverade tumörceller) på biologiskt relevanta platser för att skapa tillförlitliga prekliniska modeller för cancer forskning.
Abstract
Preklinisk testning av cancerbehandling bygger på relevanta xenograft-modeller som efterliknar de medfödda tendenserna av cancer. Fördelarna med standard subkutan flanken modeller inkluderar processuella lätthet och förmågan att övervaka tumör progression och svar utan invasiv imaging. Sådana modeller är ofta inkonsekvent i translationell kliniska prövningar och har begränsade biologiskt relevanta egenskaper med låg benägenhet att producera metastaser, som det finns en brist på en native mikromiljö. I jämförelse, har ortotop xenograft-modeller på infödda tumör platser visat att efterlikna den tumör närmiljön och replikera viktig sjukdomsegenskaper såsom avlägsen metastasering. Dessa modeller kräver ofta tråkiga kirurgiska ingrepp med narkos-tid och återställning längre. För att åtgärda detta, har cancerforskare nyligen utnyttjat ultraljud-guidad injektionstekniker för att upprätta cancer xenograft-modeller för prekliniska experiment, vilket möjliggör snabb och pålitlig inrättandet av vävnad-regisserad murina modeller. Ultraljud visualisering ger också en icke-invasiv metod för längsgående bedömning av tumör engraftment och tillväxt. Här, beskriver vi metoden för ultraljud-guidad injektion av cancerceller, utnyttja binjuren för NB och nedsatt sub capsule för ES. Detta minimalinvasiv tillvägagångssätt övervinner tråkiga öppen kirurgi implantation av cancerceller i vävnaden-specifika platser för tillväxt och metastas och avtar morbid återhämtningsperioder. Vi beskriver användningen av både etablerade cellinjer och patientens härledda cellinjer ortotop injektionsvätska. Färdiga kommersiella kit finns för tumör dissociation och luciferas taggning av celler. Injektion av cellsuspensionen med bild-vägledning ger en minimalt invasiv och reproducerbara plattform för skapandet av prekliniska modeller. Denna metod används för att skapa tillförlitliga prekliniska modeller för andra cancerformer som urinblåsa, lever och bukspottkörtel exemplifierar dess outnyttjad potential för många cancer modeller.
Introduction
Djur xenograft-modeller är viktiga verktyg för prekliniska studier av romanen cancerbehandling. Standard murina xenograft åberopa subkutan flanken implantation av celler, som ger en effektiv och lättillgänglig plats för övervakning tumörtillväxt. Nackdelen med subkutan modeller är deras brist på tumör-specifika biologiska egenskaper, vilket kan begränsa deras potential att metastasera1. Sådana begränsningar är övervinnas genom användning av ortotop xenograft i vilken tumör celler är rekonstituerades på infödda vävnad webbplatser, som ger en relevant närmiljön med metastatisk potential2. Ortotop xenograft-modeller behålla ursprungliga biologiska funktioner och ge tillförlitliga modeller för prekliniska drug discovery3,4. Cancercellerna utnyttjas för vävnad-regisserad implantation är antingen etablerade cellinjer eller patientderiverade celler från patientens tumörer. Xenograft etablerat från cancer cellinjer kan uppvisa höga genetiska skillnader från den primära tumören jämfört med patientens härledda xenograft5. Mot denna bakgrund har inrättandet av patientderiverade ortotop xenograft blivit rekommenderad standard för testning roman therapeutics i cancer drug discovery.
I den pediatric cancer neuroblastom (NB), ortotop xenograft-modeller recapitulate primärtumör biologi och utveckla metastaser till typiska platser av NB sprida6,7. NB utvecklar i binjuren eller längs kedjan paravertebral sympatisk. De vanligaste metoderna för ortotop implantation kräver öppen trans-buk kirurgiska ingrepp. Dessa metoder är ofta tråkiga, har hög djur sjuklighet och komplexa återhämtningsperioder. Högupplösta ultraljud har använts nyligen för vävnad-regisserad implantation av tumörceller i utvecklingen av flera murina modeller för cancer forskning8,9. Tekniken är pålitlig, reproducerbar, effektiv och säker för etableringen av relevanta metastaserande tumör xenograft10,11.
Inrättandet av pediatric cancer xenograft av ultraljud-styrda målet orgel lokalisering och nål implantationen av cellinjer och patientderiverade tumörceller är visat11. Tekniken utnyttjades för NB riktade mot murina binjuren. Ewings sarkom (ES) är huvudsakligen en bendefekter cancer, vanliga i långa ben såsom lårben och bäcken bena12. Fallrapporter har visat att för att avgöra om tillväxten av en huvudsakligen bendefekter cancer är genomförbart i nedsatt vävnad, en nedsatt sub kapsulära plats valdes för ortotop implantation13. Nedsatt sub kapsulära cell implantation av tumörceller har använts som en lovande modell för att studera spontana metastaser för ES14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ultraljud-guidad implantation av NB och ES-celler är en effektiv och säker metod för att fastställa tillförlitliga murina xenograft för prekliniska studier i cancerbiologi. Avgörande för framgången för ultraljud-guidad vävnad-riktade implantation är närvaro och tillgänglighet av utbildad personal med kompetens inom anatomiskt lokalisera organ av intresse och stereotaktisk injektion av tumörceller.
Dissociationen av tumörvävnad visade sig vara ett avgörande steg i att utveckla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd från Robert Wood Johnson Foundation/Amos medicinska fakulteten Development Program, Taubman Research Institute, och det avsnitt av Barnkirurgi, The University of Michigan. Författarna vill tacka Kimber Converso-Baran och Dr Marcus Jarboe för hjälpen med ultraljud injektion förfaranden och imaging-plattformen. Vi vill tacka Paul Trombley för hans hjälp med figur grafik. Vi tackar också Institutionen för radiologi på The University of Michigan för användning av The Center för molekylär Imaging och tumör Imaging kärnan, som delvis stöds av omfattande Cancer Center NIH, bevilja P30 CA046592. University of Michigan fysiologi fenotypning Core som stöds delvis av bidragsfinansiering från NIH (OD016502) och Frankel Cardiovascular Center. Cell linje autentisering gjordes på IDEXX RADIL bioforskning faciliteter, Columbia, MO. Vi tackar Tammy Stoll, Dr Rajen Mody och Mott Solid tumör onkologi Program. Våra patienter och familjer är tacksamt erkänd för sin inspiration, mod och pågående stöd av vår forskning.
Materials
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
