Impact des neurones intracardiaques sur l’électrophysiologie cardiaque et arythmogenèse dans un système de Langendorff Ex Vivo
Summary
Nous présentons ici un protocole pour la modulation du système nerveux autonome intracardiaque et l’évaluation de son influence sur l’électrophysiologie fondamentale, arythmogenèse et cAMP dynamique en utilisant une configuration de Langendorff ex vivo .
Abstract
Depuis son invention à la fin du 19ème siècle, le système de perfusion Langendorff ex vivo le cœur continue d’être un outil pertinent pour étudier un large éventail de paramètres physiologiques, morphologiques, biochimiques et pharmacologiques coeurs au centre dénervés. Nous décrivons ici une configuration pour la modulation du système nerveux autonome intracardiaque et l’évaluation de son influence sur l’électrophysiologie fondamentale, arythmogenèse et dynamique de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc). Système nerveux autonome intracardiaque est modulé par la dissection mécanique de graisse auriculaire tampons-dans les ganglions murines sont situées principalement — ou par l’utilisation d’interventions pharmacologiques ciblées mais aussi mondiales. Un cathéter électrophysiologiques octapolar est introduit dans l’oreillette droite et le ventricule droit et tableaux multi-électrode épicardique placés (MEA) pour la cartographie à haute résolution sont utilisés pour déterminer l’arythmogenèse et électrophysiologie cardiaque. Transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) d’imagerie est réalisée pour la surveillance en temps réel du taux d’AMPc dans différentes régions cardiaques. Neuromorphology est étudié au moyen d’anticorps-basée la coloration des coeurs entiers à l’aide de marqueurs neurones pour guider l’identification et la modulation des objectifs spécifiques du système nerveux autonome intracardiaque dans les études effectuées. La configuration de Langendorff ex vivo permet pour un grand nombre d’expériences reproductibles en peu de temps. Néanmoins, la nature en partie ouverte de l’installation (p. ex.., pendant les mesures de la MEA) contrôle de température constante est difficile et doit être maintenue à un minimum. Cette méthode décrite permet d’analyser et de moduler l’intracardiaque système nerveux dans les coeurs décentralisé.
Introduction
Le système de perfusion Langendorff ex vivo le cœur continue d’être un outil pertinent pour effectuer un large éventail de morphologiques, biochimiques et physiologiques, et des études pharmacologiques dans dénervé centralement coeurs1,2 ,3,4,5 depuis son invention en fin 19ème siècle6. A ce jour, ce système est encore largement utilisé pour divers sujets (p. ex.., ischémie reperfusion) ou étudier cardiaque pharmacologique effets7,8et est un outil de base en recherche cardiovasculaire. La longévité de cette méthode résulte de plusieurs avantages (p. ex.., les mesures sont effectuées sans l’influence du système nerveux central ou autres organes, circulation systémique ou hormones circulantes). Si nécessaire, produits pharmaceutiques peuvent être ajoutés de façon contrôlée dans la mémoire tampon de perfusion ou appliqués directement à des structures spécifiques. Des expériences sont reproductibles, et un nombre relativement élevé d’expériences peut être effectué dans un court laps de temps. La nature ouverte (en partie) de l’installation peut faire la régulation de la température difficile et doit être pris en compte. Bien que le système de Langendorff est également utilisé dans la plus grande espèce9, petits animaux sont principalement utilisés comme le montage expérimental est moins complexe et une plus grande variabilité biologique (p. ex.., transgéniques modèles murins) peut être utilisé.
Le dispositif expérimental du présent protocole, l’influence du système nerveux autonome intracardiaque sur base paramètres électrophysiologiques, arythmogenèse ventriculaire, conduction épicardique et dynamique de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est évalué. Un grand nombre de ganglions intracardiaques, qui sont principalement situées dans les coussinets adipeux auriculaires et sont désormais bien connus pour contrôler l’électrophysiologie cardiaque indépendant de contrôle nerveux central, est que soit laissés intacts ou supprimé manuellement avec soin mécanique dissection. Une modulation pharmacologique du système nerveux autonome est réalisée à l’échelle mondiale en ajoutant des produits pharmaceutiques vers le tampon de perfusion ou localement par modulation ciblée des ganglions auriculaires. Après les expériences, les coeurs sont bien adaptés pour une évaluation immunohistological comme toutes les cellules sanguines ont été supprimées en raison de la perfusion continue, qui permet d’augmenter la qualité de la coloration.
L’objectif global des techniques décrites est d’offrir de nouvelles perspectives pour des études détaillées concernant l’incidence du système nerveux autonome sur l’électrophysiologie cardiaque et arythmogenèse dans le coeur de souris. Une raison d’utiliser cette technique est qu’il est possible d’étudier et de modifier le système nerveux sans l’impact du système nerveux central. Un avantage majeur est l’emploi facile des expériences pharmacologiques, dans quelles propriétés antiarythmiques ou pro – potentielles de vieux et nouveaux agents peuvent être testés. En outre, des modèles de souris transgéniques et knock-out de diverses maladies cardiaques sont disponibles pour étudier les mécanismes qui sous-tendent les arythmies, insuffisance cardiaque ou des maladies métaboliques. Cette approche a amélioré notre compréhension de la façon dont le système nerveux autonome au niveau auriculaire peut avoir des répercussions électrophysiologie cardiaque ventriculaire et l’induction des arythmies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, le système de perfusion du Langendorff ex vivo coeur bien connu est présenté comme un outil pour étudier l’impact des neurones intracardiaques sur l’électrophysiologie cardiaque et arythmogenèse en utilisant la cartographie différente et les techniques de stimulation y compris les approches endocardiques et épicardiques.
Plusieurs parties du protocole sont cruciales pour le programme d’installation. Tout d’abord, il est important d’utiliser une tec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Hartwig Wieboldt pour son excellente assistance technique et l’UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) du centre médical universitaire Hamburg-Eppendorf de fournir microscopes et soutien. Cette recherche a été financée bythe Förderverein des universitaire Herzzentrums Hamburg e.V. et par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET | |
References
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