Влияние внутрисердечной нейронов на сердечной электрофизиологии и Arrhythmogenesis в системе Langendorff Ex Vivo
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для модуляции внутрисердечной вегетативной нервной системы и оценки его влияния на основные электрофизиологии, arrhythmogenesis и лагеря динамика, с помощью программы Langendorff установки ex vivo .
Abstract
С момента своего изобретения в конце 19-го века Langendorff система перфузии ex vivo сердце продолжает быть важным инструментом для изучения широкий спектр физиологических, биохимических, морфологические и фармакологические параметры в централизованно денервированных сердца. Здесь мы описываем установку для модуляции внутрисердечной вегетативной нервной системы и оценки его влияния на основные электрофизиологии, arrhythmogenesis и динамика циклический аденозинмонофосфат (лагерь). Внутрисердечной вегетативной нервной системы модулируется механических рассечение предсердий жира колодки в котором мышиных ганглии расположены главным образом — или путем использования как глобальных, так и целевых фармакологического вмешательства. Octapolar электрофизиологические катетер вводится в правого предсердия и правого желудочка, и эпикардиальной размещены массивы несколькими электродами (МПС) для сопоставления с высоким разрешением используются для определения сердечной электрофизиологии и arrhythmogenesis. Фёрстер передачи энергии резонанса (ЛАДА) изображений выполняется для реального времени наблюдения за лагеря уровнях в различных регионах сердца. Нейроморфологию изучается с помощью на основе антител окрашивание всей сердца с помощью нейронов маркеров для идентификации и модуляции конкретных целевых показателей внутрисердечной вегетативной нервной системы в проведенных исследованиях. Langendorff ex vivo установки позволяет большое количество воспроизводимых экспериментах в короткое время. Тем не менее, частично открытый характер установки (например., во время измерений МПС) затрудняет контроль постоянной температуры и должны быть сведены к минимуму. Этот описан метод позволяет анализировать и модулировать внутрисердечной вегетативной нервной системы в децентрализованных сердцах.
Introduction
Langendorff система перфузии ex vivo сердце продолжает быть важным инструментом для выполнения широкий спектр физиологических, биохимических, морфологические и фармакологические исследования в центре денервированных сердца1,2 ,3,,45 с момента его изобретения в конце 19 века6тыс . На сегодняшний день, эта система до сих пор широко используется для различных темы (например., ишемии-реперфузии) или для изучения сердца фармакологические эффекты7,8и является основным инструментом в сердечно-сосудистых исследований. Долговечность данного метода приводит к от несколько преимуществ (например., измерения выполняются без влияние центральной нервной системы или других органов, кровообращения или циркулирующих гормонов). При необходимости, Фармацевтика можно добавлять контролируемым образом буфер перфузии или непосредственно применяться к конкретным структурам. Воспроизводимость экспериментов, и относительно большое количество экспериментов могут быть выполнены в течение короткого времени. (Частично) открытый характер настройки можно сделать трудно регулирование температуры и необходимо принимать во внимание. Хотя в более крупных видов9также используется Langendorff система, мелкие животные используются главным образом как экспериментальной установки является менее сложной и большей биологической вариативности (например., трансгенные мыши модели) могут быть использованы.
В экспериментальной установки настоящего Протокола является влияние внутрисердечной вегетативной нервной системы на основные электрофизиологические параметры, желудочковой arrhythmogenesis, эпикардиальной теплопроводности и циклический аденозинмонофосфат (лагерь) динамика оценены. Большое количество внутрисердечной ганглии, которые расположены в основном в предсердной жировых отложений и теперь хорошо известны для контроля сердечной электрофизиологии независимо от центральной нейронные управления, являются либо оставить нетронутыми или вручную удалены с тщательной механической рассечение. Фармакологических модуляции вегетативной нервной системы осуществляется глобально добавив Фармацевтика в буфер перфузии или локально путем целенаправленных модуляции предсердий ганглиев. После экспериментов сердца хорошо подходят для оценки иммуногистохимического как все клетки крови были удалены из-за непрерывного перфузии, который может увеличить качество окрашивания.
Общая цель описанных методов является предложить новые перспективы для подробного исследования относительно влияния вегетативной нервной системы на сердечной электрофизиологии и arrhythmogenesis в самом сердце мыши. Причина использовать эту технику, что это можно изучить и изменить вегетативной нервной системы без влияние центральной нервной системы. Одним из основных преимуществ является легко занятости фармакологические эксперименты, в которых потенциальные про – антиаритмические свойств или старых и новых агентов могут быть протестированы. Кроме того для изучения механизмов аритмии, сердечной недостаточности или метаболических заболеваний доступны трансгенных и нокаут мыши модели различных кардиологических заболеваний. Такой подход укрепил наше понимание как вегетативной нервной системы на уровне предсердий может влиять желудочков сердца электрофизиологии и индукции аритмий.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи известный Langendorff ex vivo сердце перфузии системы представлен как инструмента для изучения влияния внутрисердечной нейронов на сердечной электрофизиологии и arrhythmogenesis с помощью различных карт и методы стимуляции включая эндокарда и эпикардиальной подходы.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Hartwig Wieboldt за его прекрасную техническую помощь и УКЭ микроскопии изображений объекта (Umif) из университета медицинский центр Гамбург-Эппендорф для микроскопов и поддержки. Это исследование было финансируемых bythe Förderverein des Universitären Гамбург Herzzentrums е.в. и DZHK (Немецкий центр исследования сердечно-сосудистой системы) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET | |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
