심장 전기 생리학 및 전 비보 Langendorff 시스템에서 Arrhythmogenesis Intracardiac 뉴런의 영향
Summary
여기, 선물이 intracardiac 자율 신경의 변조 및 기본 전기 생리학, arrhythmogenesis, 및 비보 전 Langendorff 설치를 사용 하 여 캠프 역학에 미치는 영향의 평가 대 한 프로토콜.
Abstract
늦게 19 세기에서 그것의 발명품부터 심장 관류 시스템 ex vivo Langendorff 계속 광범위 한 생리, 생화학, 형태학, 및 약리학 매개 변수에서 공부 관련 도구 중앙에서 denervated 마음입니다. 여기, intracardiac 자율 신경의 변조 및 기본 전기 생리학, arrhythmogenesis, 및 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 역학에 미치는 영향의 평가 대 한 설정을 설명합니다. Intracardiac 자율 신 경계는 murine 중추는 주로 심 방 지방 패드에 기계 해 부에 의해 변조-또는 대상 뿐 아니라 글로벌 약리학 내정간섭의 사용에 의해. Octapolar electrophysiological 테 오른쪽 아 트리 움과 우 심 실에 도입 되 고 배치 epicardial 다중 전극 배열 (MEA) 고해상도 매핑에 대 한 심장 전기 생리학 및 arrhythmogenesis 결정 하 사용 됩니다. 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워) 이미징 여러 심장 지역에 캠프 레벨의 실시간 모니터링에 대 한 수행 됩니다. Neuromorphology 항 체 기반 신경 마커를 사용 하 여 식별 및 수행 연구에서 intracardiac 자율 신경 시스템의 특정 대상의 변조를 이끌어 온 마음의 얼룩에 의해 공부 된다. Ex vivo Langendorff 설치 짧은 시간에 재현 실험의 높은 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 설치의 부분적으로 열려 자연 (예., MEA 측정 동안) 일정 한 온도 제어를 어렵게 하 고 최소한으로 유지 되어야 한다. 이 설명된 방법을 분석 하 고 분산 된 마음에 intracardiac 자율 신 경계를 조절 가능 하 게.
Introduction
심장 관류 시스템 ex vivo Langendorff 계속 광범위 한 생리, 생화학, 형태학, 수행 하기 위한 관련 도구 및 약리 연구에 중앙 마음1,2 denervated ,3,,45 후반 19번째 세기6에 그것의 발명품부터. 날짜 하려면,이 시스템은 다양 한 주제에 대 한 아직도 널리 이용 된다 (예., 국 소 빈 혈 reperfusion) 또는 연구 심장 약리 효과7,8, 그리고 심장 혈관 연구에 기본적인 도구입니다. 이 방법의 장 수 결과 여러 가지 이점에서 (예., 중앙 신경 조직 또는 다른 장기, 조직의 순환, 또는 순환 호르몬의 영향 없이 측정 수행 됩니다). 필요한 경우, 제약 관류 버퍼를 제어 방식으로 추가 하거나 특정 구조를 직접 적용할 수 있습니다. 실험은 재현성, 그리고 실험의 상대적으로 높은 숫자를 시간의 짧은 기간에 수행할 수 있습니다. 설치의 (부분적으로) 오픈 자연 온도 조절 어려운 고려 될 필요가 만들 수 있습니다. 실험적인 체제는 덜 복잡 하 고 큰 생물 다양성에 작은 동물 주로 사용 Langendorff 시스템은 또한 더 큰 종9에서 사용 되, (예., 유전자 변형 마우스 모델) 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 실험 설정에서 기본 electrophysiological 매개 변수, 심 실 arrhythmogenesis, epicardial 유도 그리고 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 역학에 intracardiac 자율 신경의 영향이입니다. 평가. 주로 심 방 지방 패드에 있습니다 그리고 지금 심장 전기 생리학 중앙 신경 제어에서 독립을 제어 하는 잘 알려진, intracardiac 중추의 많은 수는 그대로 또는 주의 기계와 수동으로 제거 왼쪽 해 부입니다. 자율 신경 약리학 변조는 세계적으로 관류 버퍼에 제약을 추가 하거나 로컬 심 중추의 타겟된 변조에 의해 수행 됩니다. 모든 혈액 세포 얼룩의 품질을 증가 시킬 수 있는 지속적인 관류로 인해 제거 된 대로, 실험 후 마음 잘 immunohistological 평가 적합 하다.
설명 기술의 전반적인 목표 심장 전기 생리학 및 마우스 마음에 arrhythmogenesis 자율 신 경계에 미치는 영향에 관한 자세한 연구에 대 한 새로운 관점을 제공 하는 것입니다. 이 기술을 사용 하 여 이유를 공부 하 고 자율 신 경계는 중추의 영향을 주지 않고 변경할 수 있다는. 주요 장점 중 하나는 오래 된 잠재적인 프로-또는 antiarrhythmic 속성에서 약리 실험의 쉬운 고용 하 고 새로운 에이전트를 테스트할 수 있습니다. 또한, 다양 한 심장 질환의 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 모델 조사 부정맥, 심장 마비, 또는 대사 질환을 기본 메커니즘을 사용할 수 있습니다. 이 접근은 어떻게 심 방 수준에 자율 신 경계 심 실 심장 전기 생리학 및 부정맥의 유도 영향 수 있다의 우리의 이해를 강화 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 잘 알려진 Langendorff ex vivo 심장 관류 시스템 다른 매핑 및 자극 기법을 사용 하 여 심장 전기 생리학 및 arrhythmogenesis intracardiac 신경의 영향을 연구 하는 도구로 서 제시 endocardial 및 epicardial 접근을 포함 하 여.
프로토콜의 여러 부분에서 설치에 대 한 중요 한 있습니다. 첫째, 심 방 지방 패드 그대로 유지 또는 myocardium 부상 없이 신속 하 게 제거 됩니다 준비 기?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 그의 우수한 기술 지원 및 평판 현미경 이미징 시설 (Umif)의 대학 의료 센터 함부르크-Eppendorf 현미경 및 지원 제공 Hartwig Wieboldt 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 투자 곁 Förderverein des Universitären Herzzentrums 함부르크 e.V. DZHK (심장 혈관 연구를 위한 독일 센터)에 의해 [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET | |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
