Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection
Summary
Champignons du charbon causent de nombreuses maladies agricoles dévastateurs. Ils sont dispersés sous forme de téleutospores dormants qui germent en réponse à des stimuli environnementaux. Nous décrivons deux méthodes pour étudier les changements moléculaires au cours de la germination : augmentation de la respiration pour détecter l’activation métabolique de mesure et l’évaluation changeant des événements moléculaires en isolant les téleutospores aux stades morphologiques distincts.
Abstract
Champignons du charbon sont les agents étiologiques de plusieurs maladies agricoles dévastateurs. Ils sont caractérisés par la production de téleutospores, qui sont des agents de dispersion à parois épaisses. Téliospores peuvent rester dormants pendant des décennies. La dormance est caractérisée par faibles taux métaboliques, suspendu la biosynthèse macromoléculaire et grandement réduit les niveaux de la respiration. À la réception des signaux environnementaux requis, téleutospores germent pour produire des cellules haploïdes, qui peuvent initier de nouveaux cycles d’infection. La germination des téliospores se caractérise par la reprise de biosynthèse macromoléculaire, une augmentation de la respiration et remaniements morphologiques. Afin de mesurer avec précision les changements dans la respiration cellulaire durant les premiers stades de la germination, nous avons développé un protocole simple utilisant un respiromètre Clark-type. Les derniers stades de la germination sont distinguent par des changements morphologiques spécifiques, mais la germination est asynchrone. Nous avons développé une technique de microdissection qui nous permet de recueillir des téliospores aux stades de germination distinctes.
Introduction
Les champignons du charbon (Ustilaginales) se composent de plus de 1600 espèces qui infectent les herbes dont les récoltes de céréale importante de maïs, l’orge et le blé, causant des milliards de dollars en pertes de récoltes par an1. Ces champignons sont caractérisés par la production de téleutospores, ont pigmenté sombrement les parois cellulaires, qui sont les agents de dispersion. Téliospores servent à protéger le matériel génétique au cours du stress de la dispersion entre les plantes hôtes et peuvent persister dans un état dormant pour les années2. Par conséquent, téleutospores sont une composante essentielle de la propagation de la maladie.
Afin d’étudier la biologie téliospores, notre laboratoire utilise le champignon de charbon modèle Ustilago maydis (U. maydis), qui est l’agent causal de la maladie « charbon commun du maïs ». Mature U. maydis téliospores sont caractérisent par l’arrêt de croissance, le métabolisme cellulaire réduit et faible niveau de la respiration cellulaire3. Dans les conditions environnementales favorables (par exemple., la présence de sucres spécifiques), U. maydis téleutospores germent et toutes les basidiospores de la méiose, production qui peuvent initier de nouveaux cycles d’infection. La germination est caractérisée par une augmentation de la respiration, l’activité Retour à métabolique et la progression à travers les stades morphologiques observables de germination4.
La première étape de germination comprend une augmentation de la respiration et de la fonction métabolique, cependant, il n’y a pas d’indications morphologiques du changement. La taille originale du changement respiratoire dans U. maydis ont été effectuées depuis plus de 50 ans, mesurant la consommation d’oxygène manométriquement avec Warburg fiole appareil5. Nous avons développé une méthode simple d’étudier les changements précis dans la respiration durant la germination des téliospores en mesurant la consommation d’oxygène pendant un cours temps de germination à l’aide d’un microrespirometer de type Clark. Nous avons déjà utilisé cette méthode pour étudier les changements de rythme respiratoire entre le type sauvage mutants avec6de mitochondries défectueuses et U. maydis cellules haploïdes et ont adapté le protocole ici pour étudier les changements dans la respiration téliospores durant germination. Ceci fournit un moyen d’identifier avec précision le moment du changement de la respiration pour que nous puissions cibler téliospores le moment venu, après le début de la germination pour étudier les événements moléculaires précoces. La progression de la germination peut être suivie au microscope une fois le promycélium émerge de la téliospore, mais la nature asynchrone a inhibé l’isolement d’assez téleutospores à un stade donné pour enquête. Nous avons développé une technique de microdissection semblable à ceux utilisés pour la fécondation in vitro pour recueillir des téliospores physiquement à des stades morphologiques distincts de la germination.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pathogènes basidiomycète biotrophe causent milliards de dollars en pertes de récoltes par an. La grande majorité de ces agents pathogènes produire des téliospores qui font partie intégrante de la dispersion fongique et reproduction sexuée. Acquérir les connaissances du développement et la germination des téleutospores est essentielle à la compréhension de la propagation des maladies dévastatrices provoquées par ces champignons. Afin d’identifier les changements moléculaires aux points de contrôle clés…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Paul Frost pour utilisation de son microrespirometer et Nicole Wagner et Alex Bell pour l’assistance technique. Ce travail a été financé par une subvention du CRSNG à B.J.S.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
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