Germinación de esta investigadora mediante el análisis de Microrespiration y microdisección
Summary
Smut hongos causan muchas enfermedades agrícolas devastadoras. Se dispersan como teliosporas latentes que germinan en respuesta a señales ambientales. Describiremos dos métodos para investigar cambios moleculares durante la germinación: aumento de la respiración para detectar la activación metabólica de medición y evaluación cambiar acontecimientos moleculares aislando teliosporas en etapas morfológicas distintas.
Abstract
Smut hongos son los agentes etiológicos de diversas enfermedades agrícolas devastadoras. Se caracterizan por la producción de teliosporas, que son agentes de dispersión de paredes gruesas. Teliosporas pueden permanecer latentes durante décadas. La latencia se caracteriza por bajas tasas metabólicas, biosíntesis macromolecular en pausa y reduce los niveles de respiración. Sobre la recepción de señales ambientales requiere, teliosporas germinan para producir células haploides, que pueden iniciar nuevas rondas de la infección. Germinación de la Teliospora se caracteriza por la reanudación de la biosíntesis macromolecular, respiración creciente y dramáticos cambios morfológicos. Para medir con precisión cambios en la respiración celular en las primeras etapas de la germinación, hemos desarrollado un protocolo simple que emplea un respirómetro tipo Clark. Las últimas etapas de la germinación se distinguen por cambios morfológicos específicos, pero la germinación es asincrónica. Hemos desarrollado una técnica de microdisección que nos permite recoger teliosporas en etapas distintas de la germinación.
Introduction
Los hongos de carbones (Ustilaginales) consisten en más de 1.600 especies que infectan gramíneas incluyendo los cereales importantes de maíz, cebada y trigo, causando miles de millones de dólares en pérdidas en los cultivos anuales1. Estos hongos se caracterizan por la producción de teliosporas, que han pigmentado oscuro las paredes celulares y son los agentes de dispersión. Teliosporas función para proteger el material genético durante las tensiones de la dispersión entre plantas hospederas y pueden persistir en estado latente por años2. Como tal, teliosporas son un componente esencial de la extensión de la enfermedad.
Para estudiar la biología de esta, nuestro laboratorio utiliza el hongo modelo de smut Ustilago maydis (U. maydis), que es el agente causal de la enfermedad ‘carbón común del maíz’. Madura U. maydis teliosporas se caracterizan por detención del crecimiento, metabolismo celular reducida y bajos niveles de respiración celular3. En condiciones ambientales favorables (por ej., la presencia de azúcares específicos), U. maydis teliosporas germinan y completar basidiosporas de meiosis, produciendo que pueden iniciar nuevas rondas de la infección. Germinación se caracteriza por respiración creciente, la actividad volver a metabólico y la progresión a través de etapas morfológicas observables de germinación4.
La etapa inicial de germinación incluye aumento de la respiración y la función metabólica, sin embargo, hay no hay indicaciones morfológicas de cambio. Las medidas originales del cambio respiratoria en U. maydis se llevaron a cabo más de 50 años, medir el consumo de oxígeno manometrically con un frasco de Warburg aparato5. Hemos desarrollado un método nuevo, simple de estudiar cambios precisos en la respiración durante la germinación de la Teliospora midiendo el consumo de oxígeno durante un tiempo de germinación utilizando un microrespirometer de tipo Clark. Anteriormente utilizamos este método para estudiar cambios en la frecuencia respiratoria entre el tipo salvaje células haploides de U. maydis y mutantes con mitocondrias defectuosas6y han adaptado el protocolo aquí para estudiar cambios en la respiración de esta durante germinación. Esto proporciona un medio de identificar con precisión el momento del cambio de la respiración por lo que podemos apuntar teliosporas en el momento apropiado después de la iniciación de la germinación para investigar los eventos moleculares tempranos. La progresión de la germinación puede ser seguida microscópicamente una vez el promycelia sale de la Teliospora, pero la naturaleza asíncrona inhibió el aislamiento de suficiente teliosporas en una etapa determinada de investigación. Hemos desarrollado una técnica de microdisección similar a los utilizados para la fertilización in vitro para recoger físicamente teliosporas en distintas etapas morfológicas de la germinación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patógenos foliares de basidiomicetos causan miles de millones de dólares en pérdidas en los cultivos anuales. La gran mayoría de estos patógenos produce teliosporas que son parte integrales de hongos dispersión y reproducción sexual. Obtener conocimiento del desarrollo y la germinación de teliosporas es fundamental para comprender la propagación de las devastadoras enfermedades causadas por estos hongos. Con el fin de identificar cambios moleculares en los puntos clave de control hemos ideado un método para ide…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Dr. Paul Frost para el uso de su microrespirometer y Nicole Wagner y Alex Bell para asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por una subvención NSERC para B.J.S.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
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