التحقيق الإنبات تيليوسبوري باستخدام تحليل ميكروريسبيريشن وميكروديسيكشن
Summary
فطريات التفحم يسبب الكثير من الأمراض الزراعية المدمرة. أنها مشتتة تيليوسبوريس الخاملة التي تنبت في استجابة لمنبهات بيئية. أننا مخطط طريقتين لتقصي التغيرات الجزيئية أثناء الإنبات: قياس زيادة التنفس للكشف عن التنشيط الأيضي وتقييم الأحداث الجزيئية المتغيرة عن طريق عزل تيليوسبوريس في المراحل المورفولوجية المميزة.
Abstract
فطريات التفحم هي العوامل المسببة للعديد من الأمراض الزراعية المدمرة. أنها تتميز بإنتاج تيليوسبوريس، وعوامل التشتت السميكة. تيليوسبوريس يمكن أن تظل نائمة لعقود. تتميز بانخفاض معدلات التمثيل الغذائي السكون ومؤقتا الحيوي الجزيئات وتقلص إلى حد كبير مستويات التنفس. عند تلقي إشارات البيئية المطلوبة، تنبت تيليوسبوريس لإنتاج خلايا فرداني، الذي يمكن بدء جولات جديدة من العدوى. تيليوسبوري إنبات يتسم باستئناف الحيوي الجزيئات وزيادة التنفس والتغييرات الشكلية المثيرة. من أجل دقة قياس التغيرات في التنفس الخلوي خلال المراحل الأولى من الإنبات، قمنا بتطوير بروتوكول بسيط توظيف ريسبيروميتير كلارك من نوع. وتتميز المراحل اللاحقة للإنبات بالتغييرات الشكلية المحددة، ولكن الإنبات غير متزامنة. قمنا بتطوير تقنية ميكروديسيكشن التي تمكننا من جمع تيليوسبوريس في مراحل إنبات متميزة.
Introduction
تتكون فطريات التفحم (سواديات) 1,600 أكثر الأنواع التي تصيب الحشائش بما في ذلك محاصيل الحبوب الهامة من الذرة والشعير والقمح، مما تسبب ببلايين الدولارات في خسائر في المحاصيل سنوياً1. تتميز هذه الفطريات بإنتاج تيليوسبوريس، الذي يكون مظلم مصطبغة جدران الخلية، وهي عوامل التشتت. تيليوسبوريس تعمل على حماية المواد الجينية أثناء ضغوط تفريق بين النباتات المضيفة، ويمكن أن تستمر في حالة سبات عميق لسنوات2. على هذا النحو، تيليوسبوريس عنصر أساسي في انتشار المرض.
من أجل دراسة البيولوجيا تيليوسبوري، يستخدم مختبرنا فطر التفحم نموذج مايديس Ustilago (U. مايديس)، الذي هو عامل المسببة للمرض ‘المشتركة التفحم للذرة’. الناضجة مايديس U. تيليوسبوريس تتميز بالقبض على النمو وانخفاض الأيض الخلوية، والمستويات المنخفضة للتنفس الخلوي3. في الظروف البيئية الملائمة (مثلاً.، وجود السكريات محددة)، تيليوسبوريس مايديس U. تنبت واستكمال الانقسام الاختزالي، تنتج باسيديوسبوريس التي يمكن بدء جولات جديدة من العدوى. الإنبات يتميز بزيادة التنفس والنشاط العودة للتمثيل الغذائي والتقدم من خلال المراحل المورفولوجية يمكن ملاحظتها لإنبات4.
وتشمل المرحلة الأولى من الإنبات زيادة التنفس ووظيفة التمثيل الغذائي، ومع ذلك، لا توجد أية مؤشرات المورفولوجية للتغيير. وأجريت القياسات الأصلية لتغيير الجهاز التنفسي في الولايات المتحدة مايديس قبل 50 عاماً، قياس استهلاك الأوكسجين مانوميتريكالي مع جهاز5قارورة واربورغ. وقد وضعنا طريقة بسيطة وجديدة لدراسة التغييرات الدقيقة في التنفس أثناء الإنبات تيليوسبوري بقياس استهلاك الأوكسجين خلال دورة وقت للإنبات باستخدام ميكروريسبيروميتير كلارك من نوع. استخدمنا هذا الأسلوب سابقا لدراسة التغيرات في معدل التنفس بين البرية من نوع مايديس U. فرداني الخلايا وطفرات مع6من الميتوكوندريا المعيبة، وتكيفت البروتوكول هنا لدراسة التغيرات في التنفس تيليوسبوري أثناء الإنبات. وهذا يوفر وسيلة لتحديد دقة توقيت التغيير التنفس حيث أنه يمكن أن نستهدف تيليوسبوريس بعد بدء الإنبات للتحقيق في الأحداث الجزيئية المبكر في الوقت المناسب. يمكن أن تتبع التقدم لإنبات مجهريا بمجرد بروميسيليا يخرج من تيليوسبوري، ولكن الطبيعة غير متزامن تحول دون عزل ما يكفي تيليوسبوريس في مرحلة معينة للتحقيق. قمنا بتطوير تقنية ميكروديسيكشن مماثلة لتلك المستخدمة للاخصاب في الأنابيب لجمع تيليوسبوريس جسديا في مراحل متميزة المورفولوجية للإنبات.
Protocol
Representative Results
Discussion
مسببات الأمراض النباتية بيوتروفيك باسيديوميسيتي تسبب مليارات الدولارات في خسائر في المحاصيل سنوياً. الغالبية العظمى من هذه الجراثيم تنتج تيليوسبوريس التي جزء لا يتجزأ من تشتت الفطرية والتكاثر الجنسي. اكتساب المعرفة التنمية وإنبات تيليوسبوريس أمر بالغ الأهمية لفهم انتشار الأمراض المدم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور بول فروست للاستخدام في بلده ميكروريسبيروميتير، ونيكول فاغنر وأليكس بيل للمساعدة التقنية. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة مقدمة إلى B.J.S.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E., Swan, A. . Meiosis – Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. , 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. . Monograph Number 2. , (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. . Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , (2013).
- Fröhlich, J., König, H., König, H., Varma, A. . Soil Biology – Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. , 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
