Расследование Teliospore прорастания с использованием Microrespiration анализа и Microdissection
Summary
Головне грибки вызывают много разрушительных сельскохозяйственных болезней. Они разбросаны как неактивных teliospores, которые прорастают в ответ на экологические сигналы. Мы приводим два метода для изучения молекулярных изменений во время проращивания: увеличение дыхание для выявления метаболических активации и оценки изменения молекулярные события, изолируя teliospores на различных этапах морфологических.
Abstract
Головне грибы являются этиологические агенты нескольких разрушительных сельскохозяйственных болезней. Они характеризуются производства teliospores, которые являются агентами толстостенные разгон. Teliospores может оставаться покоя на протяжении десятилетий. Покоя характеризуется низким метаболизма, приостановлена макромолекулярных биосинтез и значительно сократить уровни дыхания. После получения необходимых экологических сигналов, teliospores прорастают производить haploid клетки, которые могут инициировать новых раундов инфекции. Teliospore всхожесть характеризуется возобновление макромолекулярных биосинтез, увеличение дыхания и драматические морфологические изменения. Для того, чтобы точно измерить изменения в клеточное дыхание на ранних этапах всхожесть, мы разработали простой протокол, используя Кларк тип респирометра. На более поздних этапах прорастания отличаются конкретные морфологические изменения, но всхожесть является асинхронным. Мы разработали microdissection технику, которая позволяет нам собирать teliospores на прорастание отдельных этапах.
Introduction
Головне грибов (Ustilaginales) состоят из более 1600 видов, которые заражают трав, включая важные зерновых, кукурузы, ячменя и пшеницы, вызывая миллиарды долларов потерь урожая ежегодно1. Эти грибы характеризуются производства teliospores, которые загадочно пигментированные клеточной стенки и рассеивания агентов. Teliospores функция, чтобы оградить генетический материал во время стрессов разгон между растений-хозяев и могут сохраняться в неактивное состояние на2лет. Таким образом teliospores являются важным компонентом распространения болезни.
С целью изучения биологии teliospore, наша лаборатория использует модель головне гриб пузырчатая maydis (U. maydis), который является возбудителя болезни «общие головня кукурузы». Зрелые U. maydis teliospores характеризуются арест роста, сокращение клеточный метаболизм и низкий уровень клеточного дыхания3. В благоприятные экологические условия (например., наличие конкретных сахаров), U. maydis teliospores прорастают и полное мейоз, производство basidiospores, которые могут инициировать новых раундов инфекции. Всхожесть характеризуется повышенной дыхания, возвращение к метаболической активности и прогрессии через наблюдаемых морфологической стадии прорастания4.
На начальном этапе прорастания включает в себя увеличение дыхание и метаболические функции, однако, есть нет морфологических признаков перемен. Оригинальные измерения дыхания изменения в U. maydis были проведены более 50 лет назад, измерение потребления кислорода manometrically с Варбург колбу аппарат5. Мы разработали новый, простой метод изучения точные изменения дыхания при прорастании teliospore путем измерения потребления кислорода в течение времени прорастания с помощью Кларк типа microrespirometer. Ранее мы использовали этот метод для изучения изменения частоты дыхания между одичал типа U. maydis haploid клетки и мутанты с дефектных митохондрий6и адаптировали протокол здесь изучить изменения в teliospore дыхания во время всхожесть. Это обеспечивает средства точного определения сроков изменения дыхания, так что мы можем целевых teliospores в соответствующее время после начала прорастания расследовать раннего молекулярных событий. Прогрессирование прорастания может следовать микроскопически после promycelia вытекает из teliospore, но асинхронной природы тормозится изоляции достаточно teliospores на данном этапе расследования. Мы разработали технику microdissection, аналогичные тем, которые используются для оплодотворения в пробирке собрать физически teliospores в различные морфологические стадии прорастания.
Protocol
Representative Results
Discussion
Патогенов растений biotrophic базидиомицета ежегодно вызывают миллиарды долларов в потери урожая. Подавляющее большинство этих патогенов производят teliospores, которые являются неотъемлемой частью грибковых разгон и половое размножение. Получение знаний о развитии и прорастание teliospores имеет…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-р Пол Фрост для использования его microrespirometer и Николь Вагнер и Алекс Белл для оказания технической помощи. Эта работа финансировалась Сенти Грант для B.J.S.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E., Swan, A. . Meiosis – Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. , 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. . Monograph Number 2. , (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. . Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , (2013).
- Fröhlich, J., König, H., König, H., Varma, A. . Soil Biology – Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. , 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
