Undersøker Teliospore spiring ved hjelp av Microrespiration analyse og Microdissection

Summary

Sote sopp forårsaker mange ødeleggende landbruket sykdommer. De er spredt som sovende teliospores som spirer svar på miljømessige signaler. Vi skissere to metoder for å undersøke molekylær endringer under spiring: måle åndedrett økning for å oppdage metabolske aktivisering og vurdere endre molekylære hendelser ved å isolere teliospores på forskjellige morfologiske stadier.

Abstract

Sote sopp er paranoid agenter for flere ødeleggende landbruket sykdommer. De er preget av produksjon av teliospores, som er tykke vegger spredning agenter. Teliospores kan forbli sovende i flere tiår. Dormancy er preget av lav metabolsk priser og stanset macromolecular biosyntesen sterkt reduserte nivåer av åndedrett. Ved mottak av nødvendige Miljøsignaler, spire teliospores for å produsere haploid celler, som kan starte nye runder av infeksjon. Teliospore spiring er preget av gjenopptakelse av macromolecular biosyntesen, økt åndedrett og dramatiske morfologiske endringer. For å presist måle endringer i cellular respirasjon i den tidlige fasen av spirende, har vi utviklet en enkel protokoll ansette en Clark-type respirometer. Av spiring kjennetegnes av bestemte morfologiske endringer, men spiring er asynkron. Vi utviklet en microdissection teknikk som gjør det muliggjør for oss å samle inn teliospores på forskjellige spiring stadier.

Introduction

Den sote sopp (Ustilaginales) består av over 1600 arter som infisere gress inkludert viktig frokostblanding avlinger av korn, bygg og hvete, forårsaker milliarder av dollar i avling tap årlig¹. Disse sopp er preget av produksjon av teliospores, som har mørkt pigmentert cellevegger og er spredning agenter. Teliospores for å skjerme genetisk materiale under hverdagens stress spredning mellom verten planter, og kan vedvare i en sovende tilstand for år². Slik er teliospores en avgjørende del av sykdom spread.

For å studere teliospore biologi, utnytter vårt laboratorium modell sote soppen Ustilago maydis (U. maydis), som er den kausale agenten for sykdommen ‘vanlige sote korn’. Eldre U. maydis teliospores kjennetegnes av vekst arrestasjon, redusert cellenes stoffskifte og lave nivåer av cellular respirasjon³. I gunstige miljømessige forhold (f.eks., tilstedeværelse av bestemte sukker), U. maydis teliospores spirer og fullføre meiose, produksjon av basidiospores som kan starte nye runder av infeksjon. Spiring er preget av økt åndedrett, tilbake til metabolske aktiviteten og progresjon gjennom observerbare morfologiske stadier av spiring⁴.

Den innledende fasen av spiring inkluderer økt åndedrett og metabolsk funksjon, men det finnes ingen morfologiske indikasjoner for endring. Opprinnelige målinger av luftveiene endringen i U. maydis ble utført over 50 år siden, måle oksygenforbruk manometrically med en Warburg kolbe apparater⁵. Vi har utviklet en ny, enkel metode for å studere nøyaktig endringer i åndedrett under teliospore spiring ved å måle oksygenforbruk en gang løpet av spiring bruker en Clark-type microrespirometer. Vi har tidligere anvendt denne metoden for å studere endringer i respirasjonsfrekvens mellom vill-type U. maydis haploid celler og mutanter med defekt mitokondrier⁶, og har tilpasset protokollen her for å studere endringer i teliospore åndedrett under spiring. Dette gir et middel til å nøyaktig identifisere tidspunktet for åndedrett endre slik at vi kan målrette teliospores på riktig tidspunkt etter initiering av spiring undersøke tidlig molekylære hendelser. Utviklingen av spiring kan følges mikroskopisk når promycelia kommer fra teliospore, men den asynkrone måten hemmet isolering av nok teliospores på et gitt tidspunkt for undersøkelse. Vi utviklet en microdissection teknikk som ligner på de som brukes for i vitro fertilisering fysisk samle teliospores på forskjellige morfologiske stadier av spiring.

Protocol

1. korn Cob infeksjon Vokse Zea mays (cv. Golden Bantam) til cobs er dannet og har begynt å silke (ca 60 dager). Kultur kompatibel haploid U. maydis stammer ved hjelp av standardprotokoller som tidligere beskrevet7. Infisere korn cobs ved hjelp av standardprotokoller som beskrevet tidligere7. 2. teliospore høste Autoclave utstyr (Büchner trakter, Büchner flasker, blandemaskiner, …

Representative Results

Med Clark-type microrespirometer-baserte metoden å måle endringer i åndedrett teliospore dormancy og spiring bekreftet vi at sovende teliospores ha et lavt nivå av åndedrett (~ 1,075 µmol/h/mg) sammenlignet med spirende teliospores (~ 2,614 µmol/h/mg; Figur 1A). Dette representerer en ~2.4-fold endring i Gjennomsnittskurs ånding mellom sovende teliospores og teliospores som har blitt overtalt til å spire. I tillegg har vi identifisert som teliospores…

Discussion

Basidiomycete biotrophic plante patogener føre milliarder av dollar i avling tap årlig. De aller fleste av disse patogener produsere teliospores som er integrert i fungal spredning og seksuell reproduksjon. Få kunnskap om utvikling og spiring av teliospores er avgjørende for å forstå spredning av ødeleggende sykdommer forårsaket av disse sopp. For å identifisere molekylær endringer på sentrale kontrollpunktene har vi utviklet en metode for å identifisere tidspunktet for fysiologiske endringer, og en annen for…

Materials

Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004