Здесь мы представляем протокол для изготовления пластин градиента nanopattern через тепловые nanoimprinting и метод скрининга ответы клеток человека эндотелиальной прародитель наноструктур. С помощью описанных технологий, можно производить эшафот, что можно управлять поведение клеток, физические раздражители.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изготовление градиента Nanopattern тепловой Nanoimprinting техникой и проверка реакции человека эндотелиальные клетки, образуя колонии
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нанотопографии могут быть найдены в различных внеклеточной матрицы (ECMs) вокруг тела и как известно, имеют важные регламентационных на клеточных реакций. Однако трудно определить связь между размером наноструктур и реакции клеток из-за отсутствия надлежащей проверки инструментов. Здесь мы покажем развития воспроизводимых и экономически градиента nanopattern пластин для манипуляции клеточных реакций. Использование анодного оксида алюминия (ААО) в качестве главной формы, градиент nanopattern плиты с nanopillars хребтов увеличения диаметра [120-200 Нм (GP 120/200), 200-280 Нм (GP 200/280) и 280-360 Нм (GP 280/360)] были сфабрикованы тепловой импринтинга технику. Эти пластины градиента nanopattern были разработаны для имитации различных размеров нанотопографии в ECM и были использованы для экран ответов человека эндотелиальных образуя колонии клеток (hECFCs). В этом протоколе опишем шаг за шагом процедура изготовления градиента nanopattern пластины для ячейки, инженерия, технологии выращивания hECFCs из периферической крови человека и культивирования hECFCs на nanopattern пластины.
Введение
Недавно реакция клеток по физической стимуляции топографии поверхности была освещена в поле ячейки инженерных1,2,3,4. Таким образом больше внимания было уделено трехмерной наноструктур на поверхности клеток вложений5. Сообщается, что Интегрин, который является устройством поверхности признание ячейки, передает физический раздражитель, управляемый микро нано составами ECM-механо трансдукция6. Это механическая стимуляция регулирует поведение клеток через контакт руководство7
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование был одобрен Советом по рассмотрению институциональных больнице Анам университета Кореи (IRB № ED170495). Все процедуры были проведены в соответствии с Хельсинкской декларации и последующих поправок к нему.
1. подготовка субстрата алюминия (Al), электрополировка
Осторожностью: Электрополировка решение коррозионные и токсичных. Носите личного защитного оборудования, включая нитриловые перчатки, защитные очки и халате. Выполните этот шаг в зонта.
- Приготовляют раствор электрополирование, смешивая этилового спирта (C2H5OH, 99,9%) и хлорной кислоты (HClO....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 показывает SEM изображения изготовлены формы градиента ААО согласно их тип и расположение. Рисунок 2 показывает изображения SEM градиента nanopattern плит с регулярными округлые nanopillars, и на рисунке 3 приведена количественная оценка данных nanopillar диаметра. В таблице 1 перечислены характеристики сфабрикованных nanopillars.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Изготовление AAO часто страдает от такие дефекты, как трещины, неправильной формы поры, и горения. Основная причина этих дефектов называется электролитической пробоя, которая сильно зависит от характера металлические субстраты анодированный и сопротивление электролита21. Поскольку сопротивление электролита варьируется в зависимости от его температуры, устраняя тепла непрерывно с электродами является критической точки для поддержания местоположением температуры электролита стабильным в таком состоя.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством образования, науки и технологии (MEST) [СР 2015R1D1A1A01060397] и био и медицинской технологии развития Программа финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования [СР 2017M3A9C6029563] СР НАТО.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Хлорная кислота 60% | Daejung Chemicals & Металлы | 6512-4100 | |
| Этиловый спирт, абсолютный 99,9% | Daejung Chemicals & Металлы | 4118-4100 | |
| Фосфорная кислота 85% | Daejung Chemicals & Металлы | 6532-4400 | |
| Метиловый спирт 99,5% | Daejung Chemicals & Металлы | 5558-4400 | |
| Оксид хрома (VI) | Daejung Chemicals & Металлы | 2558-4400 | |
| Серная кислота 95% | Daejung Chemicals & Металлы | 7781-4100 | |
| Перекись водорода 30% | Daejung Chemicals & Металлы | 4104-4400 | |
| н-гексан 95% | Daejung Chemicals & Металлы | 4081-4400 | |
| Толуол 99,5% | Daejung Chemicals & Металлы | 8541-4400 | |
| (гептадекафтор-1,1,2,2,-тетрагидродецил)диметилхлорсилан | Гелест | SIH5840.4 | Влагочувствительный |
| Метоксинонафторбутан 99% | Сигма олдрич | 464309 | |
| Раствор коллагена | Стволовые клетки | #4902 | |
| Желатин | Сигма олдрич | G1890 | Раствор |
| белковой оболочкиFicoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Раствор гидрофильного полисахарида |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Среда для роста эндотелиальных клеток |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140-122 | |
| Фосфат буферный физиологический раствор | Gibco | 10010031 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 12483-020 | |
| Параформальдегид | Sigma aldrich | P6148 | |
| Глутаральдегид | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Тетраоксид осмия | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Гексаметилдисилазан | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Октилфенолэтоксилат |
| Козья сыворотка | Gibco | 26050-088 | |
| против человеческого винкулина первичное антитело | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-актиновый зонд | Молекулярные зонды | A12379 | Флуоресцентно-конъюгированный фаллоидин |
| Alexa Fluor 488-конъюгированный антимышиный | Молекулярные зонды | A11001 | Флуоресцентно-конъюгированное вторичное антитело |
| 4',6-диамидино-2-фенилиндол | Sigma aldrich | D9542 | |
| Монтажная среда | DAKO | S3023 | |
| Первичные антитела против человека vWF | DAKO | A0082 | |
| Антигуманный Первичное антитело к CD144 | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Набор для встраивания, с BDMA | Ted Pella | 18012 | Эпоксидная смола |
| Uranyl Ацетат, 25 г | Ted Pella | 19481 | |
| Цитрат свинца, тригидрат, 10 г | Ted Pella | 19312 | |
| Ультра чистая алюминиевая пластина | Goodfellow | 26050-088 | |
| Лист полистирола | Goodfellow | ST313120 | |
| 8,0" кремниевая пластина | Siltron | 29-01024-03 | Односторонняя полировка, 725 & микро m толстый |
| вакуумный эксакатор, 4,4 л Kartell | KA.230 | ||
| Вакуумный насос | Vacuumer | V3. VOP100 | |
| Блок питания | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Магнитная мешалка | Daihan scientific | SL. | |
| Верхняя мешалка | Daihan scientific | HT120DX | |
| Циркуляционный насос | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Линейный движущийся столик | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Угловой кронштейн, 90 градусов | Zaber | AB90M | Аксессуар линейного подвижного стола |
| PMP щипц, 145 мм | Vitlab | 67995 | Неметаллический пинцет |
| Стакан из ПТФЭ, 250 мл | Cowie | CW007.25 | |
| Ультразвуковой очиститель | Branson | B2510MTH | |
| Резак для печатных плат | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Устройство наноотпечатка | Nanonex | NX-2000 | |
| Генератор кислородной плазмы | Femto Science | CUTE | |
| Низкотемпературный стерилизатор | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Инкубатор | Panasonic | MCO-18AC | |
| Лазерный сканирующий микроскоп Confoal | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Сканирующий электронный микроскоп | JEOL | JSM6701 | |
| Просвечивающий электронный микроскоп | Hitachi | H-7500 |
Ссылки
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
