Termal Nanoimprinting teknik ve insan endotel hücreleri koloni oluşturan yanıt testi ile taranması degrade Nanopattern imalatı
Summary
Burada, degrade nanopattern plakaları termal nanoimprinting ile imalat ve insan endotelyal progenitor hücreler yanıt taşınımı için eleme yöntemi için bir iletişim kuralı mevcut. Açıklanan teknolojisini kullanan, hücre davranış fiziksel uyaranlara tarafından işleyebilirsiniz bir iskele üretmek mümkündür.
Abstract
Nanotopography çeşitli hücre dışı matrisler (ECMs) vücut etrafında bulunabilir ve hücresel reaksiyonlar üzerine önemli yasal eylemleri sahip olduğu bilinmektedir. Ancak, bir nanostructure boyutunu ve hücre uygun tarama araçları eksikliği nedeniyle yanıt arasındaki ilişkiyi belirlemek zordur. İşte, tekrarlanabilir ve düşük maliyetli degrade nanopattern plakaları hücresel yanıt manipülasyon gelişimini göstermektedir. Ana kalıp, degrade nanopattern pilakalar ve artan çap aralığı [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) ve 280-360 nm (GP 280/360)] nanopillars olarak anodik alüminyum oksit (AAO) kullanarak basma tekniği bir termal tarafından fabrikasyon. Bu degrade nanopattern plakaları nanotopography ECM içinde çeşitli boyutlarda taklit etmek için tasarlanmıştır ve insan endotel koloni oluşturan hücre (hECFCs) yanıt-e doğru elemek için kullanılmıştır. Bu protokol için mühendislik, hECFCs insan periferik kandan yetiştirilmesi ve hECFCs nanopattern plakaları kültür teknikleri hücre için degrade nanopattern tabak imalatı, adım adım bir yordam açıklanmaktadır.
Introduction
Yanıt hücre yüzey topografyası fiziksel uyarılması tarafından son zamanlarda, hücre mühendislik1,2,3,4alanında kataloglarımızda. Bu nedenle, daha fazla dikkat hücre ek yüzey5üç boyutlu nanoyapıların üzerinde duruldu. Bu hücre yüzey tanıma oyunlarından biri, integrin ECM mikro-nano yapılar ile mekanik iletim6tarafından tahrik fiziksel uyarıcı iletir bildirilmiştir. Bu mekanik stimülasyon hücre davranış ile ilgili rehberlik7 düzenleyen ve odak yapışıklıklar ve sertlik hücre8‘ in yanı sıra şeklini değiştirmek için hücre iskeleti yeniden yapılanma neden olmaktadır.
İnsan endotelyal progenitor hücreler (hEPCs) vücuttaki yakından çevreleyen ECM9microenvironment ile etkileşim. Bu kesme stres kan akışı10‘ dan türetilmiş kadar ECM fiziksel durumunu belirli hücre-matris yapışması karmaşık oluşumu için önemli bir parametre olarak davranır gösterir. Bu yüzey nanotopography geniş kılcal tüp ağlar hEPCs11 ‘ in vitro oluşumunu artırır ve ECM/biyo çözünür faktör sistem kombine hEPCs işlevsel olmayan yüzeylerde tanımasını sağlar ve destekler bildirilmektedir şifa12,13yara. Yine de, ECM ve hEPCs arasındaki ilişkiyi açıkça anlaşılmış değildir.
Hücre yanıtları ve fiziksel ipuçları farklı yüzeylerde14,15,16arasındaki ilişkiyi açıklamak için pek çok araştırmacı çalıştı rağmen bu çalışmalar bir nanostructure yalnızca sabit boyutu kullanılan veya nanopatterns nanostructure ve hücre davranışını boyutu arasındaki ilişkiyi aydınlatmak için bir sınırlama var düzensiz düzenlemeler ile. Buradaki sorun nanostructure en uygun boyutu bulmak için varolan sıkıcı ve yinelemeli yaklaşımlar yerine hücresel yanıt süzmek için uygun araçlar eksikliğidir. Bu nedenle, basit bir teknik tekrarlama olmadan fiziksel elektrodlar hücre reaksiyonlar eleme için gereklidir.
Burada, bizim önceki raporlar17,18,19 içinde hangi görücü usulü nanopillars çapını yavaş yavaş artar bir degrade nanopattern üretmek için kullanılan bir yöntem açıklanmaktadır. Buna ek olarak, ayrıca nasıl yetiştirmek ve hECFCs fiziksel bir çekim gücü etkisi hücreleri belirlemek için degrade nanopattern plakaları davranışını analiz nitelendirdi. Hafif anodization, yavaş yavaş gravür ve anti-yapışma katman kaplama yöntemi degrade AAO kalıp imal etmek kullanılmıştır. Litografi tekniği basma bir termal benimseyerek, aynı polistren degrade nanopatterns bir maliyet-etkin ve facile şekilde üretilmiştir. Degrade nanopatterns kullanarak, hangi boyutunu nanostructure deney bir dizi hücre davranışı üzerinde büyük bir etkiye sahip belirlemek için mümkün olabilir. Biz bu gradyan nanopattern kan kaynaklı hECFC veya diğer hücreler ve taşınımı çeşitli boyutlarda arasındaki etkileşim mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır bekliyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sık sık bir AAO imalatı kusurları çatlaklar, gözenekleri ve yazma düzensiz şekiller gibi muzdarip. Ana nedeni bu kusurları için güçlü Eloksal metal yüzeylerde yapısı ve elektrolit21direnci etkilenir elektrolitik bir arıza denir. Bağlı olarak sıcaklık elektrolit direnci değişir bu yana ısı sürekli elektrotlar ortadan kaldırmak olarak böyle bir yüksek gerilim Eloksal durum ahırda elektrolit gerektirebileceği sıcaklığı korumak için kritik nokta olduğunu. Bu ileti?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Milli Eğitim Bakanlığı, bilim ve teknoloji (MEST) [NATO Mukabele Gücü-2015R1D1A1A01060397] ve biyolojik ve tıbbi teknoloji geliştirme tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir NMG Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama [NATO Mukabele Gücü-2017M3A9C6029563] tarafından finanse edilen program.
Materials
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
