Summary

閉ループ慣性マイクロ流路を用いた患者由来気道分泌からラベル無料好中球の濃縮

Published: June 07, 2018
doi:

Summary

本研究ではスパイラル慣性マイクロ流体システムの閉ループの操作を使用して臨床の気道分泌物からラベル無料好中球分離法を紹介します。提案手法は、様々 な呼吸器疾患の臨床の in vitroアッセイを拡大します。

Abstract

気道分泌物には、多数免疫関連細胞、例えば、好中球、マクロファージ、リンパ球は、さまざまな肺疾患、研究および臨床目的のための両方を評価する主要なリソースとして使用することができますにはが含まれています。しかし、患者の粘液の異種と粘性の性質のためありません現在メソッドがあります信頼性の高い解離患者気道分泌の宿主の免疫細胞に被害はありません。本研究では慣性マイクロ流体を使用して、患者さんの免疫の評価のためのサンプル調製法を紹介します。臨床サンプルの異種流体プロパティに関係なく、提案手法は 1,000 倍希釈、気道分泌物のサンプルから好中球の 95% 以上を回復する清潔な生理食塩水のミリリットルと。初期サンプル貯水池へ集中している出力ストリームを再循環によって高濃度、回復、および免疫細胞の純度は用意されています。再循環は、トレードオフが伴う慣性マイクロ流体の単一実行注射器ベースの操作と見なされます。スパイラル マイクロ流体システムの閉ループ操作ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) によって示されるように物理的または化学的にせずに、白血球を提供します-並べ替えられた好中球のエラスターゼ遊離。

Introduction

細胞は多量の気道分泌物で粘液にカプセル化されて、以来の in vitroアッセイによる白血球の機能評価を妨げられています。ジチオトレイトール (DTT) は最も一般的な換散バッファーを切り離して、細胞学的分析と単離細胞1,2の許容性を提供しながら調停の検出の喀痰を均質化します。ただし、DTT はエラスターゼおよびミエロペルオキシダーゼ (MPO) リリース2,3など好中球機能の中断の結果気道好中球表面結合抗原を妨げることができます。したがって、末梢血好中球肺4の生理学的特性を明らかにするかもしれないとひと気道好中球機能のいくつかの研究が行われています。一方、慣性マイクロは、様々 な患者のマトリックス5,6から細胞を分離することを進歩させてをきました。慣性の揚力とディーン ドラッグ間の平衡により、ラベル無料粒子分離7彼らの大きさに応じて粒子/セルに配置します。当社グループは以前循環腫瘍細胞8,98病原体、細胞懸濁液文化1011,からの試料作製法を導入した12と多形核白血球 (PMNs) 血13,14から。

好中球エラスターゼ (NE) アッセイなど、下流の in vitroアッセイの閉ループ慣性マイクロを使用して患者さんの気道分泌物から免疫細胞を準備するためのプロトコルを紹介します。このメソッドは、セル/粒子の元、セル/粒子の金利が削除される臨床サンプルでよく観察される横方向に重要な重複がある場合は特に、高濃度と復旧の両方を提供します。内部壁 (IW) を再循環によって-廃棄物の貯留層を通過する小さな粘液骨材を用いた背景流体中大きな粒子またはセルへ入力サンプル チューブ、粒子や貯水池の元セルの関心集中を集中。臨床サンプルの異種流体特性、にもかかわらず提案手法を一貫して好中球 1,000 倍希釈、気道分泌物のサンプルからの 95% 以上回復 (〜 1 mL) きれいな食塩水で。対照的に、換散方法は Pmn の広い範囲のサンプル条件によって回収率を示します。提案プロトコルは、物理的あるいは化学的停止することなく、臨床的に低侵襲と生体に挑戦から繊細な細胞を収穫する可能性を提供するが無料のラベルに白血球をキャプチャします。

Protocol

サンプル コレクションは、ピッツバーグ大学制度審査委員会 (IRB # PRO16060443, PRO10110387) によって承認されました。すべての実験は、バイオ セーフティ キャビネット適切な個人用保護具付けの下で実行されます。 1. デバイス作製とソフト ・ リソグラフィー 注: 標準的なソフト ・ リソグラフィー技術15,16はポ…

Representative Results

孟とマイクロ流体解離 (図 3 a) を DTT と両方で透明な免疫細胞懸濁液を達成しました。マイクロ解離収集 105 Pmn x 4.40 平均 (2.1 x 10 x 10 の5 Pmn 5.60 に4 n = 6) 気道分泌のサンプルから 1,000 倍希釈 (容量 50 mL) きれいな懸濁液の 1 mL に。初期希釈 94.0 %pmn と比較して (CD66b+/CD45+) 6 臨床サンプルにわたって一貫して、…

Discussion

慣性マイクロ粒子と細胞は、マイクロ流路のサイズ5,18,19,20に基づいて特定の水平位置にローカライズします。ディーンの複合効果による力と慣性の揚力曲線マイクロ、大きな粒子、好中球をドラッグ (> 10 μ m) 6 より小さいチャネルと小さな粒子、粘液の集計、および残骸の中にある μ m を配置以…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIH U24 サンプル温存法プログラム (U24 AI118656) だけでなく、NIH/NIAID (R21AI119042) によって支えられました。

Materials

PDMS precursor Dow corning 184 SIL ELAST KIT 3.9KG 10:1 ratio of base and curing agent
VWR gravity convection oven VWR 414005-128 PDMS precursor to be cured in 90 deg.
100mm petri dish VWR 89000-324 Fabrication of PDMS Supporting layer
Harris Uni-core puncher Sigma-aldrich WHAWB100076 2mm diameter or other depending on the tubing size
Air plasma machine Femto Science Cute Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base.
2” x 3” glass slide TED PELLA, INC. 2195 To support PDMS device
Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 Cole-Parmer EW-96410-14 Tubing for microfluidics and peristlatic pump
1/16 inch Luer connector, male Harvard apparatus PC2 72-1443 Connector for fluid guide
50mL Falcon tube Corning 21008-940 sample collection & preparation
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium Corning 45000-446  Buffer solution to dilute sample
Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm HALYARD HEALTH 22113 Tracheal seceation suction catheter
0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe BD PosiFlush NHRIC: 8290-306547 For tracheal seceation collection from the patients
SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL Simport 1176R36 Sterile sputum (airway secretion) collection container
Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL BD BD309604 To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
BD  Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok  Tip BD To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
40µm nylon cell strainer  Falcon 21008-949 To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel.
Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) Cole-Parmer HV-07522-30 operation of microfluidics
BD LSR II flow cytometer BD Bioscience LSR II flow cytometer Quantification of cell recovery ratio
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody BD Bioscience 561927 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody BD Bioscience 561864 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Plate reader Thermo Fisher scientific Varioskan Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525
Neutrophil elastase assay kit Cayman Chemical 600610 Neutrophil functionality assessment
Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm PolyScience, Inc. 18140-2 Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics

References

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Ryu, H., Choi, K., Qu, Y., Kwon, T., Lee, J. S., Han, J. Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics. J. Vis. Exp. (136), e57673, doi:10.3791/57673 (2018).

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