폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축
Summary
이 연구에서 임상 기도 분 비 물이 나선형 관성 마이크로의 폐쇄 루프 작업에서 레이블 없는 호 중구 분리 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법 분석 실험 임상 생체 외에서 다양 한 호흡기 질환에 대 한 확장 이라고 합니다.
Abstract
기도 분 비의 면역 관련 세포, 예, 호 중구, 대 식 세포, 림프 톨, 폐 질환, 연구 및 임상 목적을 위해 둘 다의 다양 한 평가를 주요 자원으로 사용 될 수 있는 큰 숫자를 포함. 그러나, 이기종 및 점성의 특성상 환자 점액, 거기 현재 없습니다 신뢰할 수 있는 분리 방법이입니다 환자 기도 분 비에서 호스트 면역 세포를 손상 하지 않는다. 이 연구에서 우리는 환자의 면역 평가 대 한 관성 마이크로 사용 하는 샘플 준비 방법 소개. 임상 샘플의 이종 유체 속성에 제안된 된 방법 1,000-fold 희석 하는 기도 분 비 샘플에서 호 중구의 95% 이상 복구와 깨끗 한 식 염 수의 밀리 리터. 초기 샘플 저수지에 집중된 출력 스트림에 재순환 하 여 높은 농도, 복구, 및 면역 세포의 순도 제공 됩니다; 재순환 관성 마이크로의 단일 실행 주사기 기반 작업에 교환으로 간주 됩니다. 나선형 마이크로의 폐쇄 루프 작업 제공 물리적 또는 화학적 방해 없이 백혈구 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)에 의해 증명-정렬 된 호 중구 elastase 출시를 유도.
Introduction
이후 셀 기도 분 비 물에 점액의 다량에 캡슐화, 생체 외에서 시험에 의해 백혈구의 기능 평가 방해 되었습니다 있다. Dithiothreitol (DTT)는 해리 cytological 분석 및 격리 된 셀1,2의 쾌활 생존을 제공 하면서 중재자의 검출에 대 한가 래를 균질 하 가장 일반적인 세포의 용 해 버퍼. 그러나, DTT 방해할 수 있습니다 기도 중 성구의 표면 바인딩된 항 같은 elastase myeloperoxidase (MPO) 릴리스2,3호 중구 기능 장애의 결과로. 따라서, 인간의 기도 호 중구 기능 몇 가지 연구와 말 초 혈액 호 중구, 폐4의 생리 적 특성을 드러내지 수 있습니다 실시 되었습니다. 한편, 관성 마이크로 다양 한 환자 biomatrices5,6에서 세포를 분리 하는에서 발전을 했다. 딘 끌어서 관성 리프트 힘 사이 평형 입자/셀 라벨 무료 입자 분리7를 수 있는 그들의 크기에 따라 정렬 합니다. 우리의 그룹은 이전 순환 종양 세포8,9, 혈액8병원 체, 세포는 현 탁 액 문화10,11, 를 위한 샘플 준비 방법 소개 12, 및 polymorphonuclear 백혈구 (PMNs) 혈액13,14에서.
여기, 다운스트림 시험관에서 분석 결과, 같은 호 중구 elastase (NE) 분석 결과 대 한 폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자의 기도 분 비 물에서 면역 세포를 준비 하는 프로토콜을 소개 합니다. 셀/입자의 있는 셀/입자-의-관심은 제거 되어야 하는 임상 견본에서 일반적으로 관찰 되는 측면 방향에 상당한 중복 하는 경우에 특히 높은 농도 및 복구,이 메서드를 제공 합니다. 내부 벽 (IW)를 재순환 하 여-작은 mucin 집계 배경 액체 폐기물 저수지를 통과 하는 동안 큰 입자 또는 셀 입력된 샘플 튜브, 입자 또는 원래 저수지에서 셀의 관심 집중에 다시 집중. 임상 샘플의 이종 유체 속성에도 불구 하 고 제안된 된 방법 1,000-fold 희석 하는 기도 분 비 샘플에서 호 중구의 95% 이상 일관 되 게 복구 솔루션과 깨끗 한 식 염 수 (~ 1 mL). 대조적으로, 세포의 용 해 방법 샘플 조건에 따라 회수율 PMNs의 넓은 범위를 제공합니다. 제안 된 프로토콜 임상 도전 최소한 침략 적 절차와 생체 인식에서 섬세 한 세포 수확에 물리적 또는 화학적 중단 없이 레이블 없는 방식으로 백혈구를 캡처합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
관성 마이크로 입자 및 셀의 크기5,18,,1920에 따라 마이크로 채널에서 특정 측면 위치에 지역화 합니다. 학장의 결합된 효과의 한 힘 및 곡선된 아닌, 큰 입자 또는 호 중구에 관성 리프트 힘을 끌어 (> 10 µ m) 있는 내부 채널 및 작은 입자, 점액 집계, 및 파편 6 보다 작은 µ m 위치 특정 흐름 속도에서 채?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH U24 샘플 살려주는 분석 결과 프로그램 (U24-AI118656) 뿐만 아니라 NIH/NIAID (R21AI119042)에 의해 지원 되었다.
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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