Kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak hasta kaynaklı hava yolu salgı dan etiket içermeyen nötrofil zenginleştirme
Summary
Bu araştırmada, sarmal atalet Havacilik kapalı çevrim işlemi kullanılarak klinik hava yolu salgıları bir etiket içermeyen nötrofil ayırma yöntemi göstermektedir. Önerilen yöntem çeşitli solunum yolu hastalıkları klinik vitro deneyleri artıracağı.
Abstract
Hava yolu salgıları hücreleri bağışıklık ile ilgili, Örneğin, nötrofiller, makrofajlar ve lenfositler, göğüs hastalıkları, araştırma ve klinik amaçlar için hem de çeşitli değerlendirmek için önemli bir kaynak olarak kullanılan çok sayıda içerir. Ancak, hasta mukus türdeş olmayan ve yapışkan doğası gereği yoktur Şu anda hasta havayolu salgı ana bilgisayar bağışıklık hücreleri zarar vermez hiçbir güvenilir ayrılma yöntemi. Bu araştırmada, hastanın bağışıklık değerlendirmesi için atalet Havacilik kullanan bir örnek hazırlama yöntemi tanıtmak. Klinik örneklerin heterojen Akışkan özellikleri ne olursa olsun, önerilen yöntem nötrofil % 95’den fazla 1000 kat daha fazla sulandırılmış hava yolu salgı örneklerinden kurtarır mililitre temiz salin ile. İlk örnek rezervuar konsantre çıktı akışına sirkülasyon tarafından yüksek konsantrasyon, kurtarma ve bağışıklık hücreleri saflığı sağlanmaktadır; devridaim bir ticaret-off tek tarafından işletilen şırınga tabanlı işleyişi ile atalet Havacilik olarak kabul edilir. Sarmal Havacilik kapalı çevrim işlemi lökosit fiziksel veya kimyasal karışıklık olmadan phorbol 12-myristate 13-asetat tarafından (PMA) gösterildiği gibi sağlar-elastase yayın sıralanmış nötrofil indüklenen.
Introduction
Hücreler mukus hava yolu salgıları içinde büyük miktarda içinde kapsüllü beri bir vitro tahlil tarafından lökositlerin işlevsel değerlendirme engel. Dithiothreitol (DTT) ayırmak ve balgam saytolojik analiz ve izole hücreler1,2tolere edilebilir canlılığı sağlarken arabulucu tespiti için homojenize için en yaygın lizis tampon var. Ancak, DTT hava yolu nötrofil, yüzey bağlı antijenleri ile elastase ve myeloperoxidase (MPO)2,3serbest bırakmak gibi nötrofil fonksiyon bozulma sonucu etkileyebilir. Bu nedenle, insan hava yolu nötrofil fonksiyon kaç çalışmalar pulmoner4fizyolojik özellikleri gösterebilir değil periferik kan nötrofil ile yapılmıştır. Bu arada, atalet Havacilik çeşitli hasta biomatrices5,6hücreleri yalıtmaya gelişmeler yaptı. Dean sürükle ve atalet Asansör güçleri arasında denge parçacık/hücre etiket içermeyen parçacık ayrılık7sağlar onların büyüklüğüne göre hizalar. Bizim grup daha önce dolaşımdaki tümör hücreleri8,9, kan8patojenler, hücreleri bir süspansiyon kültürü10,11, için bir örnek hazırlama yöntemi tanıtıldı 12ve polimorfonükleer lökosit (PMNs) kan13,14.
Burada, bir hastanın solunum yolu salgıları nötrofil elastase (NE) tahlil gibi bir aşağı akım vitro tahlil için kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak bağışıklık hücreleri hazırlamak için bir protokol tanıtmak. Özellikle hücre/olan kaldırılacak, hücre/parçacık-in-ilgi olduğunu klinik örneklerinde yaygın olarak gözlenen parçacık yanal yönünde önemli bir çakışma olduğunda bu yöntem yüksek konsantrasyon ve kurtarma, sağlar. İç duvar (IW) recirculating tarafından-arka plan sıvıları küçük müsin toplamları ile atık su deposu geçmek iken büyük parçacıkları veya giriş örnek tüp, partikül veya özgün depo, faiz hücre konsantreleri geri hücrelere duruldu. Klinik örnekler heterojen Akışkan özellikleri rağmen nötrofil 1000 kat daha fazla sulandırılmış hava yolu salgı örneklerinden % 95’i yukarıda önerilen yöntem tutarlı bir şekilde kurtarır temiz tuz solüsyonu (~ 1 mL). Buna karşılık, lizis Yöntem kurtarma oranları örnek koşula bağlı olarak bir geniş PMNs aralığı sunuyor. Önerilen protokol lökosit klinik olarak minimal invaziv yordamlar ile biyometrik zorlu hassas hücreler hasat imkanı sağlar hiçbir fiziksel veya kimyasal bozulma ile etiket içermeyen bir şekilde yakalar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atalet Havacilik içinde bir mikro-kanallı onların boyutu5,18,19,20üzerinde belirli bir lateral pozisyonda, parçacık ve hücre belirle. Dekan Birleşik etkisi nedeniyle kuvvet ve atalet kabiliyeti eğri microchannel, büyük parçacıkları veya nötrofil sürükleyin (> 10 µm) Kanal ve küçük parçacıklar, mukus toplamları ve enkaz içinde 6’dan daha küçük yer alan µm konumlandı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH U24 örnek tutumlu tahlil programı yanı sıra (U24-AI118656) (R21AI119042) NIH/NIAID tarafından desteklenmiştir.
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
