Label-fri neutrofile berigelse fra Patient-afledte luftvejene sekretion ved hjælp af lukkede kredsløb Inertial mikrofluidik
Summary
I denne forskning viser vi en etiket-fri neutrofile adskillelse metode fra kliniske luftveje sekreter med lukket kredsløb drift af spiral inertial mikrofluidik. Den foreslåede metode ville udvide klinisk in vitro- assays til forskellige luftvejssygdomme.
Abstract
Luftveje sekreter indeholder et stort antal immun-relaterede celler, fx, neutrofiler, makrofager og lymfocytter, som kan bruges som en stor ressource til at evaluere en række forskellige lungesygdomme, både til forskning og kliniske formål. Men på grund af de heterogene og tyktflydende karakter af patient slim, der er i øjeblikket ingen pålidelig dissociation metode, der ikke skader vært immunceller i patientens luftveje sekretion. I denne forskning introducere vi præparationsmetode stikprøve, der bruger inertial mikrofluidik for patientens immunforsvar vurdering. Uanset de heterogene fluidic egenskaber af de kliniske prøver, den foreslåede metode genindvinder mere end 95% af neutrofiler fra luftvejene sekretion prøver, der er fortyndet 1.000-fold med milliliter af rent saltvand. Af recirkulerende koncentreret outputstream til den oprindelige stikprøve reservoir, leveres en høj koncentration, recovery og renhed af immunceller; recirkulation anses et trade-off for single-run sprøjte-baseret funktion inertial mikrofluidik. Lukket kredsløb driften af spiral mikrofluidik giver leukocytter uden fysiske eller kemiske forstyrrelser, som det fremgår af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA)-induceret elastase frigivelse af sorterede neutrofiler.
Introduction
Da cellerne er indkapslet i en stor mængde slim i luftvejene sekreter, er funktionel vurdering af leukocytter ved en in vitro- assay blevet forhindret. Dithiothreitol (DTT) er den mest almindelige lysisbuffer at adskille og homogeniseres sputum cytologiske analyse og påvisning af mæglere samtidig tolerable levedygtighed af isolerede celler1,2. Dog kan DTT interferere med overflade-bundet antigener af luftvejene neutrofiler, hvilket resulterer i afbrydelse af neutrofile funktion såsom elastase og myeloperoxidase (MPO) frigive2,3. Derfor er få undersøgelser af menneskers luftveje neutrofile funktion blevet gennemført med perifert blod neutrofiler, som ikke kan afsløre de fysiologiske egenskaber af pulmonal4. I mellemtiden, inertial mikrofluidik har gjort fremskridt i isolere celler fra forskellige patient biomatrices5,6. Ligevægt mellem inertial lift styrker og Dean træk justerer partikel/celle efter deres størrelse, som giver mulighed for etiket-fri partikel adskillelse7. Vores gruppe tidligere indført præparationsmetode prøve for cirkulerende tumor celler8,9, patogener i blod8, celler fra en suspension kultur10,11, 12, og polymorfnukleære leukocytter (PMNs) fra blod13,14.
Her introducerer vi en protokol for at forberede immun celler fra patientens luftveje sekreter med lukket kredsløb inertial mikrofluidik for en downstream i vitro assay, såsom neutrofile elastase (NE) assay. Denne metode giver både høj koncentration og nyttiggørelse, især når der findes en betydelig overlapning i lateral retning af den celle/partikel hvorfra den celle/partikel-af-interesse er at blive fjernet, der er almindeligt observeret i kliniske prøver. Af recirkulerende indre væg (IW)-fokuseret store partikler eller celler tilbage til input prøveglas, partikel eller celle-af-interesse koncentrerer sig i den oprindelige reservoir, mens baggrunden væsker med små mucin aggregater passere gennem affald reservoiret. Trods de heterogene fluidic egenskaber af kliniske prøver, den foreslåede metode genopretter konsekvent over 95% af neutrofiler fra luftvejene sekretion prøver, der er fortyndet 1.000-fold med en ren saltvandsopløsning (~ 1 mL). Derimod præsenterer metoden lysis en bred vifte PMNs genfindingsprocent afhængigt af prøven tilstand. Den foreslåede protokol indfanger leukocytter i en etiket-fri måde med ingen fysiske eller kemiske forstyrrelser, som giver mulighed for at høste sarte celler fra klinisk udfordrende biometri med minimalt invasive procedurer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I inertial mikrofluidik lokalisere partikel og celler på en bestemt lateral position i en mikro-kanal er baseret på deres størrelse5,18,19,20. På grund af den kombinerede effekt af dekanen træk kraft og inertial lift kraften i buede microchannel, store partikler eller neutrofile (> 10 µm) er placeret inde i kanal og små partikler, Slim aggregater og snavs mindre end 6 µm er placeret ude…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH/NIAID (R21AI119042) samt NIH U24 prøve besparende assay program (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
