लेबल-रोगी से मुक्त न्युट्रोफिल संवर्धन-व्युत्पन्न Airway स्राव का उपयोग बंद पाश Inertial Microfluidics
Summary
इस शोध में, हम एक लेबल-मुक्त सर्पिल inertial microfluidics के बंद लूप आपरेशन का उपयोग नैदानिक airway स्राव से न्युट्रोफिल जुदाई विधि प्रदर्शित करता है । प्रस्तावित विधि विभिंन श्वसन रोगों के लिए इन विट्रो परख में नैदानिक विस्तार होगा ।
Abstract
Airway स्राव प्रतिरक्षा से संबंधित कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में होते हैं, जैसे, न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, और लिम्फोसाइटों, जो एक प्रमुख संसाधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है फेफड़े के रोगों की एक किस्म का मूल्यांकन, दोनों अनुसंधान और नैदानिक प्रयोजनों के लिए. हालांकि, रोगी बलगम की विषम और चिपचिपा प्रकृति के कारण, वहाँ वर्तमान में कोई विश्वसनीय पृथक्करण विधि है कि रोगी airway स्राव में मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं को नुकसान नहीं करता है. इस शोध में, हम एक नमूना तैयारी विधि है कि रोगी की प्रतिरक्षा आकलन के लिए inertial microfluidics का उपयोग करता है परिचय । नैदानिक नमूनों की विषम द्रवित गुणों की परवाह किए बिना, प्रस्तावित विधि airway स्रावी नमूनों से न्यूट्रोफिल के ९५% से अधिक ठीक हो जाता है कि १,००० पतला कर रहे हैं-साफ खारा के मिलीलीटर के साथ गुना. प्रारंभिक नमूना जलाशय, एक उच्च एकाग्रता, वसूली, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की शुद्धता के लिए केंद्रित उत्पादन स्ट्रीम reसंचारित द्वारा प्रदान की जाती हैं; संचलन एक व्यापार माना जाता है-एक सिरिंज inertial microfluidics के आधार आपरेशन चलाने के लिए बंद । सर्पिल microfluidics के बंद लूप आपरेशन शारीरिक या रासायनिक अशांति के बिना ल्यूकोसाइट्स प्रदान करता है, के रूप में phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) द्वारा प्रदर्शन-हल elastase के प्रेरित न्यूट्रोफिल रिलीज ।
Introduction
के बाद से कोशिकाओं airway स्राव में बलगम की एक बड़ी राशि में समझाया जाता है, ल्यूकोसाइट्स के कार्यात्मक आकलन एक इन विट्रो परख में बाधा गया है । Dithiothreitol (डीटीटी) सबसे आम lysis बफर अलग कर देना और homogenize विश्लेषण और मध्यस्थों का पता लगाने के लिए थूक कोशिकाविज्ञान जबकि अलग कोशिकाओं1,2की संतोषजनक व्यवहार्यता प्रदान करने के लिए है । हालांकि, डीटीटी airway न्यूट्रोफिल की सतह-बाउंड एंटीजन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप elastase और myeloperoxidase (MPO) रिलीज़2,3के रूप में न्युट्रोफिल फ़ंक्शन का विघटन होता है । इसलिए, मानव airway न्युट्रोफिल समारोह के कुछ अध्ययनों परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल, जो फुफ्फुसीय4की शारीरिक विशेषताओं का खुलासा नहीं हो सकता है के साथ आयोजित किया गया है । इस बीच, inertial microfluidics विभिंन रोगी से अलग कोशिकाओं में अग्रिम किया है5,6। inertial लिफ्ट बलों और डीन खींचें के बीच संतुलन उनके आकार, जो लेबल मुक्त कण जुदाई7की अनुमति देता है के अनुसार कण/ हमारे समूह पहले एक नमूना तैयारी विधि परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं के लिए शुरू की8,9, रक्त8में रोगजनकों, एक निलंबन संस्कृति से कोशिकाओं10,11, 12, और polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (PMNs) से रक्त13,14.
यहां, हम एक रोगी के airway स्राव से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तैयार करने के लिए बंद का उपयोग-पाश inertial microfluidics इन विट्रो परख में एक बहाव के लिए, जैसे न्युट्रोफिल elastase (NE) परख के रूप में एक प्रोटोकॉल परिचय । इस विधि दोनों उच्च एकाग्रता और वसूली प्रदान करता है, खासकर जब वहाँ एक महत्वपूर्ण ओवरलैप कक्ष/कण से जो कक्ष/कण-का-ब्याज है, जो सामांयतः नैदानिक नमूनों में मनाया जाता है की पार्श्व दिशा में है । भीतरी दीवार (IW) को परिचालित करके-बड़े कणों या कोशिकाओं को वापस इनपुट नमूना ट्यूब करने के लिए, कण या सेल के ब्याज मूल जलाशय में केंद्रित है, जबकि छोटे mucin समुच्चय के साथ पृष्ठभूमि तरल पदार्थ अपशिष्ट जलाशय के माध्यम से गुजरती हैं । नैदानिक नमूनों की विषम द्रवित गुणों के बावजूद, प्रस्तावित विधि लगातार airway स्रावी नमूनों से न्यूट्रोफिल के ९५% से ऊपर है कि १,००० पतला कर रहे है-एक साफ खारा समाधान (~ 1 एमएल) के साथ गुना से उबरने । इसके विपरीत, lysis विधि नमूना शर्त के आधार पर PMNs वसूली दरों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रस्तुत करता है । प्रस्तावित प्रोटोकॉल कोई शारीरिक या रासायनिक व्यवधान के साथ एक लेबल मुक्त तरीके से ल्यूकोसाइट्स कब्जा है, जो ंयूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं के साथ चिकित्सकीय चुनौतीपूर्ण बायोमैट्रिक्स से नाजुक कोशिकाओं फसल की संभावना प्रदान करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
inertial microfluidics में, कण और कोशिकाओं को अपने आकार5,18,19,20के आधार पर एक माइक्रो चैनल में एक निश्चित पार्श्व स्थिति में स्थानीयकृत । डीन ड्रैग फोर्स और घुमावदार microchannel ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH/NIAID (R21AI119042) के साथ ही NIH U24 नमूना संयम परख कार्यक्रम (U24-AI118656) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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