Summary
Burada, bitki virülans bitki patojeni ile test etmek için bir iletişim kuralı mevcut Magnaporthe grisea. Bu rapor mantarlar yalıtır pathotypes büyük ölçekli tarama için katkıda bulunmak ve moleküler ıslahı sırasında bitkilerin dirençli mekanizmaları anlamak için mükemmel bir başlangıç noktası olarak hizmet.
Abstract
Bitkiler tarafından patojen mantarlar olası tehditlere karşı kendilerini savunmak için güçlü bir sistemi sahip. Heilbroner önemli bitkiler, ancak, böyle patojenler mücadele için geçerli önlemler çok muhafazakar kanıtladık ve, böylece, değil yeterince etkili ve potansiyel olarak çevresel riskler doğurabilir. Bu nedenle, kontrol bitki hastalıklarının doğal olarak dayanıklı Pangenez tanımlaması, yalıtım ve direnç genleri karakterizasyonu ve moleküler üreme yoluyla yardımcı olan ana bilgisayar-direnç faktörleri tanımlamak son derece gereklidir dayanıklı çeşitlerin. Bu bağlamda, işte doğurmak ve bitki direnç genleri geliştirmek için doğru hızlı ve büyük ölçekli aşılama yöntemi kurmanız gerekir. Pirinç mantar patojen Magnaporthe grisea nedenleri ciddi hastalık belirtileri şok ve kayıp verim. Son zamanlarda, M. grisea bitki mantar patojen etkileşim mekanizmaları eğitim için bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, biz geliştirme, M. griseaiçin belirli bir bitki virülans test yönteminin raporu. Conidial süspansiyon ile sprey aşı ve yaralama aşılama miselyum küpleri veya conidial süspansiyon damlacıkları ile bu yöntem sağlar. Yaralama aşılama yöntemi müstakil pirinç yaprakları için önemli bir adım olan ana bilgisayar penetrasyon direnci tarafından neden herhangi bir müdahale önler bitki yaprakları, yaraya yapmaktır. Bu sprey yaralama/iletişim kuralı M. grisea yalıtır pathotypes hızlı, doğru ve büyük ölçekli tarama için katkıda bulunur. Bu entegre ve sistematik bitki bulaşma yönteminin içinde bitki patoloji konuların geniş bir bakış açısı kazanmak için mükemmel bir başlangıç noktası olarak hizmet verecek.
Introduction
Pirinç patlama, M. griseatarafından neden pirinç çeşitleri Dünya çapında1,2için en ciddi hastalıklardan birisidir. Conidia üretim ve yüzey eki, conidia çimlenme ve appressorium oluşumu, penetrasyon peg ve bulaşıcı hypha farklılaşma, bir oluşum hangi ana bitkiler M. grisea bulaşan işlemi içerir ve bir hastalık yaymak 3. tüm bu aşamaların birçok diğer bitki patojenik mantar yaygındır ve gerçekten de, herhangi bir tek kademeli bir abluka ana bitkiler enfeksiyonu önler. Ekonomik önemi ve genetik tractability sayesinde M. grisea bitki mantar patojen etkileşimleri1,4mekanizmaları eğitim için bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, bu gelişim aşamalarında M. grisea olarak moleküler temeli eğitim mantar patojen ve kimlik tarama ve tasarımı roman için aday hedef genlerin temel moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yardımcı olacak Mantar ilaçları5.
Son raporlar M. grisea enfeksiyon ile ilgili ön penetrasyon aşamaları, özellikle conidiation, appressorium formasyonu, penetrasyon mandal ve bulaşıcı büyüme3, moleküler mekanizmaları üzerinde odaklanmıştır 6. bu nedenle, M. grisea enfeksiyon sınamak için detaylı bir protokol geliştirmek için önemlidir. Burada, biz karşı conidial bir süspansiyon ve yaralar aşılama M. griseamycelial fişleri ile sprey-aracılı enfeksiyon deneyleri kullanan enfeksiyon testi için detaylı bir yöntem mevcut. Bu raporda, kültür conidiation çözüm püskürtme için hazırlanması ve M. griseaile bitkilerin mycelial tak-aracılı aşı suşları, protokol odaklanır. Aşağıdaki adımları aşağıda ayrıntılı ve tüm iş akışı yöntemi gösterilen bir şematik açıklanmış ve tipik bir lezyon gösterilir rakamlar 1 ve 2, sırasıyla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sprey aşı M. grisea Conidia süspansiyon
-
Mantar kültürü M.grisea için
- Yulaf ezmesi domates agar (OTA) kültür orta mantar suşları için hazırlayın.
- Yulaf ezmesi 30-50 g ağırlığında, bu 800 mL distile/deiyonize su (GKD2O) ekleyin ve karışımı için 30 dk içinde elektrik pot kaynatın.
- Gazlı bez bir parça aracılığıyla kabı içine haşlanmış yulaf ezmesi suyu filtre.
- Ölçek filtrate 150 mL domates suyu ve agar 20 g ekleyin ve eklemek GKD2O kadar 1000 mL.
-
Deneysel malzeme hazırlanması
- Pirinç (Oryza sativa) çeşidinde Lijiangxintuan-heigu (LTH) GKD2O 3 d için yaklaşık 50 tohumları tadını çıkarın veya arpa yaklaşık 50 tohumları ıslatın (Hordeum vulgare cv altın söz) GKD2O 1 d için.
- Pirinç veya arpa tohumları içinde nemli gazlı bez sarın ve onları çapı 10 cm x 10 cm 28 ° C'de yaklaşık 30 Petri yemeklerinde nemli filtre kağıt üzerinde çimlenme Pirinç tohum çimlenme süresi yaklaşık 2-3 d, arpa tohum çimlenme süresi yaklaşık 2 d. Sera içinde bağıl nem oranı yaklaşık % 70 olduğunu.
- Pirinç veya arpa Fideler autoclaved Çömlekçilik toprak ve sulama kullanmak kaplarda bitki ve sonra onları vermikülit bir tabaka ile kaplayın.
- Bitkiler bir uygun glasshouse veya büyüme yaklaşık 1 için 25 ° C'de kabine koyun ~ 2 hafta.
- Filtre kağıdı çevrelerin 3 kat (her daire bir 8 cm çapında olmalı) Steril Cerrahi makas ile kesme ve 100 mm Steril plastik tabaklar koyun.
- GKD2O filtre kağıdı emmek için her yemeğin için ekleyin.
- Filtre kağıdı tamamen ıslak olduğundan emin olun ama hiçbir ilave su ekleyin.
- Bir vakum pompası ile herhangi bir fazla suyu kaldırın.
- Place 2 steril kürdan pirinç/arpa desteklemek için kültür çanak içine bırakır; Kürdan uzay ~ 2-3 cm arayla.
- Tohum Ekim sonra 2 hafta pirinç yaprakları toplamak veya tohum Ekim sonra yapraklarını arpa 7 d almak.
- 4 - 6 yaprak fidan pirinç/arpa kullanarak ~ 5 cm üst alt kısmındaki kök kesmek ve yaprakları toplamak.
-
Sprey aşı Protokolü
- OTA plakaları termostatik kuluçka (25 ° C) ~ 4 d için mantar strain kültür.
- GKD2bir 0.5 - 5 mL pipet her 4 bayat plaka kullanarak O ~ 2 mL ekleyin.
- Bir aşı döngü ile mycelia enkaz mycelia M. grisea vahşi tipi zorlanma ve mutant suşu kazı.
- Mycelia enkaz toplamak ve yeni bir OTA tabağa aktarın. Mycelia enkaz ve darbe kuru temiz tezgah al.
- Gazlı bez bir sera 25 ° c (14 saat) gün ve 23 ° C conidia büyüme için 24-48 h gecelik (10 h) için gerekli nem sağlamak için 3 kat ile plaka kapak.
- Her yemek için GKD2O 2 mL ekleyin ve conidia yavaşça bir filtrasyon objektif kağıt 2 katmanı üzerinden takip steril pamuk temizleme bezi ile kazımak. Kültür ortamının yuzeysel değil dikkatli olun.
- Conidia süspansiyon 100-1000 µL pipet ile yeni bir 50 mL tüp içine aktarın.
- 5000 x g 25 ° C'de en az 5 dk santrifüj
- Süpernatant kaldırmak ve Pelet 2 x 104 conidia mL başına %0,025 (v/v) ara-20 çözüm vermek için resuspend. Ara-20 genellikle yaklaşık 10-20 mL çözümdür.
- Spor süspansiyon el püskürtücü dökün.
- Yaklaşık 10 mL conidial süspansiyon üzerine 2 haftalık pirinç fidan veya arpa pirinç yaprakları yaprakları 7 bayat arpa fidan spay ve onları kontrol tertibatları (v/v) ara-20 çözüm % 0,025 ile 25 ° c ~ 24 h. sprey için karanlık, nemli bir odasında kuluçkaya.
- 12 h bir photoperiod için 25 ° c floresan ışığı altında başka bir nemli odasına yapraklarını aktarın.
- 5 d, hastalık belirtileri aşılama sonra kaydedin. ~ 6 cm uzunluğunda hastalıklı pirinç/arpa bıçaklar inceleyin. Standart değerlendirme skorlama sistemi uluslararası pirinç Araştırma Enstitüsü (IRRI) için patlama direnci için göre yapılır. Patlama direnci için Puanlama sistemini ayrıntılarını Tablo 1' de gösterilmiştir.
- Yaprak test suşlarının enfeksiyon değerlendirmek için fotoğraf. Enfeksiyon lezyonlar 3.6 cm2başına sayısına göre değerlendirildi.
2. aşı miselyum küpleri veya damlacıklar Conidial süspansiyon, M. grisea yaralama
- Anatomik bir iğne kullanarak, üç 2-3 cm ana damarlar müstakil pirinç/arpa yaprak uzun yaralarda kazımak; yaprakları nüfuz değil için dikkat ediniz.
- Alıntı yaprakları kürdan üzerinde koymak ve %0.02 (v/v) ara-20 çözüm damlacıkları bir tabaka oluşturmak için yaprakların üzerine sprey.
- 0.5 cm x 0.5 cm mycelial tak her M. grisea zorlanma (vahşi-türü, mutasyona uğramış, tamamlayıcı suşları veya diğer test suşlarının) için bir OTA plaka kes.
- Mycelial fiş koymak veya 25 µL damlacıkları conidial süspansiyon üzerine yaralı bırakır ve yapraklar 3-8 d için nemli bir odasında 25 ° C'de kuluçkaya.
- 5-7 d sonrası aşılama, lezyonlar inceleyin. Sprey aşı yöntemi için olduğu gibi muayene yöntemi aynıdır (bkz. Adım 1.3.13).
- ~ 6 cm uzunluğunda hastalıklı pirinç/arpa bıçaklar incelemek ve fotoğraf onları test suşlarının enfeksiyon değerlendirmek için. Enfeksiyon lezyonlar 3.6 cm2başına sayısına göre değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm iş akışı tekniği için Şekil 1' de gösterilen. 14 günlük eski duyarlı pirinç fidan üzerinde bitki enfeksiyon deneyleri gerçekleştirilmiştir (O. sativa cv CO-39) veya duyarlı 7 bayat arpa bırakır (H. vulgare cv altın söz)7,8,9. Enfeksiyon pirinç yapraklarda sınamak için bir conidial askıya (1.0 x 105 Sporlar/mL) M. grisea vahşi tipi zorlanma P131 ve Com1 silme mutant suşu kurumlara ve 14 günlük eski duyarlı yaprak kılıf püskürtülür O zaman 5 d10için nemli bir odasında tutuldu CO-39 fidan. P131 aşısını CO-39 pirinç Blast tipik sağlam lezyonlar görüntülenen bırakır ama Com1 aşısını yaprakları açık enfeksiyon kusur gösterdi ve tam enfeksiyon (Şekil 2A) temin değil. Vahşi-türü zorlanma P131 Sen-Liang Peng tarafından 198818' elde bir yük olduğunu. MoKMT2H null mutant (ΔMoKMT2H) Cao vd. hedef Gen değiştirme strateji11kullanarak bizim Laboratuvarı tarafından elde edildi. Com1 mutant Yang et al. Sen-Liang Peng'ın laboratuvar10tarafından izole.
M. grisea ΔMoKMT2H yaralar ile ana hücreleri enfekte olup olmadığını kontrol etmek için yaprakları vahşi tipi pirinç bitkileri ΔMoKMT2H yolu ile sprey yöntemi mycelial fiş veya yaralama yöntemi11ile aşılanmış çizikler. Sprey- ΔMoKMT2H ile aşılanmış yaprakları P131/yaban-tür gerilme ile karşılaştırıldığında ΔMoKMT2H enfeksiyon hiçbir bariz hataları saptandı; Ancak, bariz hataları ile ΔMoKMT2H yaralar (Şekil 2A) ile aşılanmış yaprakları için tespit edildi. Daha fazla bitki enfeksiyon arpa yapraklarla, sağlıklı ve yaralı yaprak test etmek (cv altın söz) conidial damlacıkları veya mycelial prizler, sırasıyla, Com1, ΔMoKMT2Hveya P131 aşısını. Daha az ve daha küçük lezyonlar Com1 mutant (Şekil 2 ile aşılanmış yapraklarda bulundu, ancak 5 d sonrası aşılama tipik pirinç patlama lezyonlar tamamen ΔMoKMT2H veya P131 zorlanma, ile aşılanmış yaprakların üzerine gelişen B).
Resim 1 : Bitki enfeksiyon gösteren bir düzeni. Bitki tohumları germinated toprak plastik tencere (50 mm2 x 50 mm ile bir drenaj delik derin), iki pot tohum ve fide bir serada yetiştirilen. Kültür ve aşı patlama mantar M. grisea OTA tabaklarda yetiştirilmiştir. Aşılama yöntemi püskürtme conidia için conidia süspansiyon %0.02 (v/v) ara-20 çözüm askıya ve pirinç/arpa bitkiler püskürtülür. Çizik aşılama yöntemi için alıntı pirinç/arpa bitki yaprakları plastik tabaklar üzerinde koymak ve sonra mycelial bir fiş veya conidia süspansiyon tarafından aşılandı. Ve sonra bütün tedavi tesisi yaprakları 24 h için karanlık kültürlü ve ışık-kültürlü 12 h için. Son olarak, kolonileri içinde 3.6 cm2 adet sayısı kaydedildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Com1 ve MoKMT2H bir conidium oluşumu ve pirinç yapraklarda patojenitesi için gereklidir. (A)Bu panel gösterir pirinç aşı bırakır (solda) ile conidia sprey veya mycelial tak (sağda) ile M. grisea vahşi tipli P131 üzerinden conidia, mutant Com1veya ΔMoKMT2H. Tipik yaprakları mycelial tak-aracılı aşılama, hangi aşınır pirinç yapraklarda yapılmıştır sonra 7 d tespit edildi. Tipik lezyonlar 5 d mycelial tak-aracılı aşı sonra tespit edildi. (B) arpa yaprakları vardı aşısını conidia sprey (solda) ile veya mycelial tak (sağda). Sahte tedavi denetimi olarak (v/v) ara-20 çözüm % 0,025 aynı hacmi püskürtülür. Yara aşılama için P131 figürü Cao ve ark. değiştirildi. 11. ascomycete mantar içinde MoKMT2H Ash1, H3K4 ve H3K36 metilasyonu11' karıştığı bir işlevsel homolog olduğunu. Bar 1 cm =. Δcom1 mutantlar virülans pirinç ve arpa fidan10içinde önemli ölçüde azaltıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Ölçek | Açıklama |
| 1 | Toplu iğne nokta boyutu küçük kahverengi lekeleri |
| 2 | Küçük yuvarlakça biraz uzun, nekrotik gri lekeler, yaklaşık 1-2 mm çapında, belirgin kahverengi marjı. Lezyonlar çoğunlukla üst yapraklarda bulunan |
| 3 | Lezyon türü 2 ile aynıdır, ancak önemli sayıda lezyon theupper yapraklarda |
| 4 | Tipik duyarlı patlama lezyonlar, 3 mm veya daha uzun, hastalık daha az theleaf alanının % 4'üne |
| 5 | Tipik duyarlı patlama lezyonlar, 3 mm veya daha uzun, bulaşmasını yaprak alanının 4-%10 daha az |
| 6 | Tipik duyarlı patlama lezyonlar, 3 mm veya yaprak alanının % 11-25'den daha uzun, bulaşmasını az |
| 7 | Tipik duyarlı patlama lezyonlar, 3 mm veya yaprak alanının % 26-50'den daha uzun, bulaşmasını az |
| 8 | Tipik duyarlı patlama lezyonlar, 3 mm veya yaprak alanının birçok yaprakları ölü 51-75 %'den daha uzun, bulaşmasını az |
| 9 | Tipik duyarlı patlama lezyonlar, 3 mm veya daha uzun, bulaşmasını fazla yaprak alanının % 75 |
Tablo 1: patlama direnci için skor sistemi. Tablo Uluslararası pirinç Araştırma Enstitüsü (IRRI) üzerinden çağırılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bitki hastalık direnç genleri fungal patojenlerin1,12de dahil olmak üzere patojenlerin enfeksiyon önlemede önemli bir rol oynamaktadır. Pirinç patlama patojen nüfus yapıları doğasını anlamak ve bitki direnç genleri4belirlemek için bir model olarak kullanılmıştır. Bu nedenle, hastalık direnci genotip ve avirulence genotip sürekli ekili olabilir hastalığı dayanıklı bitkiler tanımlamak için büyük ölçüde tarım bitkilerin ana çeşitlerinin incelemek gereklidir. Ayrıca, avirulence genotip alan patojenlerin avantajları ana bilgisayar çeşitleri12,13farklı dayanıklı genotip rasyonel dağılımı gerektirebilir. Ancak, geçerli aşılama yöntemleri yaygın tarama direnç ve patojen kimlik14,15,16,17için müdahale.
Burada, bitki enfeksiyon için test etmek için hızlı ve doğru bir yöntem mevcut. Bu aşı yöntemi denemeler ıslahı sırasında ve direnç genleri klonlama sırasında bir döl nüfus fenotip, dayanıklı bitkiler tanımlaması için uygundur. Burada, kurduk yaralı bitki aşı yöntemi ile M. griseabırakır. Çünkü ana direnç bir patojen yayılmasını önlemede önemli bir rol oynar, test edilmiş pirinç yaraya üretilen bu vitro Yöntemi bırakır ve yaranın üzerine pirinç patlama aşısını, enfeksiyon doğrudan oluşturmak için uygundur yaprak epidermis ve epidermal hücre duvarı nüfuz zorunda kalmadan yaprakları. Ayrıca, bu aşı yöntemi farklı yaprak yaş için uygundur. Aşı istikrarlı ve doğru sonuçlarıdır. Aşı yaralama yöntemi aşı ile mycelia için conidia sadece düşük miktarda üretmek mantar suşları patojenitesi tanımlamak için kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı daha fazla izin karşı ve onun konak13doğuştan gelen bağışıklık bastırmak için bir mantar patojen özgü faktörler yanı sıra mantarlar korunmuş patojen mekanizmaları anlayışımızı katkıda bulunacaktır. Ancak, yara aşılama conidial işgali ve mycelia genişleme oranını belirlemek çalışırken geçerli değildir. Ama doğal durumda sprey aşı yöntemi patojen bir patojenin daha iyi yansıtabilir. Sprey aşı yöntemi kullanımı kolay ve iş verimliliğini artırmak için yardımcı olur. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar bir doğru ve kararlı aşılama yöntemi tarama için gerekli gösteren bitki direnç genleri ve patojen belirleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser özel bilimsel araştırma projesi Pekin Tarım Üniversitesi (YQ201603) ve bilimsel proje Pekin Eğitim Komitesi (KM201610020005) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401 (2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430 (2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
