Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att testa anläggningen virulens med växt patogen Magnaporthe familjen. Detta betänkande kommer att bidra till storskalig screening av patotyper av svampar isolat och tjäna som en utmärkt utgångspunkt för att förstå de resistenta mekanismerna av växter under molekylär avel.
Abstract
Växter äger ett kraftfullt system för att försvara sig själva mot potentiella hot av patogena svampar. För agriculturally viktiga växter, men nuvarande åtgärder för att bekämpa sådan patogener har visat sig vara alltför konservativ och, således, inte tillräckligt effektiva, och de kan potentiellt innebära miljörisker. Därför, är det ytterst nödvändigt att identifiera värd-motstånd faktorer att bistå i kontrollerande växtsjukdomar naturligt genom identifiering av resistenta arvsmassa, isolering och karakterisering av antibiotikaresistensgener och molekylär avel resistenta sorter. I detta avseende finns det behöver upprätta en korrekt, snabb och storskalig inokuleringsmetod för att odla och utveckla anläggningen antibiotikaresistensgener. Riset ger förluster och spränga svamp patogener Magnaporthe familjen orsakar svår sjukdomssymtom. Nyligen, M. familjen har vuxit fram som en modellorganism för att studera mekanismerna i växt-svamp patogener interaktioner. Därför rapporterar vi utvecklingen av en växt virulens testmetod som är specifik för M. länkar. Denna metod ger för både spray inympning med en conidial fjädring och skadade inympning med mycel kuber eller droppar conidial suspension. Det viktiga steget i den skadade inokuleringsmetod för fristående ris bladen är att göra sår på växtblad, vilket undviker störningar från värd penetration motstånd. Denna spray/såra protokollet bidrar till snabb, korrekt och storskalig screening av patotyper av M. familjen isolat. Detta integrerade och systematiska växten infektion metod kommer att tjäna som en utmärkt utgångspunkt för att få ett brett perspektiv på problem i växtpatologi.
Introduction
Ris blast, orsakad av M. länkar, är en av de mest allvarliga sjukdomarna för ris sorter i hela världen1,2. Processen som infekterar M. familjen värdväxter omfattar en conidia produktion och ytan fastsättning, en conidia grobarhet och appressorium-formationen, en formation av penetration peg och smittsamma hypha differentiering, och en sjukdom sprids 3. alla dessa stadier är vanliga i många andra växt patogena svampar, och, faktiskt, en blockad av någon enda steg förhindrar infektion av värdväxter. På grund av dess ekonomiska betydelse och genetiska tractability, M. familjen har vuxit fram som en modellorganism för att studera mekanismerna i växt-svamp patogener interaktioner1,4. Därför hjälper studera den molekylära basen för dessa utvecklingsstadier i M. familjen till att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom svamp patogenicitet och identifiering av mål kandidatgener för screening och utforma roman fungicider5.
Senaste rapporter om M. familjen infektion har fokuserat på de molekylära mekanismerna av före penetration arrangerar, särskilt conidiation, appressorium bildandet, penetration pinnarna och den smittsamma tillväxt3, 6. det är därför viktigt att utveckla ett detaljerat protokoll för att testa M. familjen infektion. Häri, presenterar vi en detaljerad metod för en infektion test som använder spray-medierad infektion analyser med en conidial fjädring och inympning av sår med mycelial pluggar av M. länkar. I den här rapporten fokuserar protokollet på kulturen av stammar, utarbetandet av den conidiation lösningen för sprutning och mycelial plug-medierad inympning av växter med M. länkar. Dessa steg beskrivs i detalj nedan, och en schematisk vy visar hela arbetsflödet för metoden och en typisk lesion visas i figurerna 1 och 2, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. spray inympning med en Suspension av M. familjen Conidia
-
Svamp kultur för M.grisea
- Förbereda odlingssubstratet havregryn tomat agar (OTA) för svamp stammar.
- Väger 30-50 g havregryn, tillsätt detta till 800 mL destillerat/avjoniserat vatten (ddH2O) och koka blandningen i 30 min i elektriska potten.
- Filtrera kokt havregrynsgröt saften i bägaren genom en bit gasbinda.
- Tillsätt 150 mL tomatjuice och 20 g agar till filtratet i bägaren och ddH2O upp till 1 000 mL.
-
Beredning av experimentella material
- Blötlägg ca 50 frön av ris (Oryza sativa) sort Lijiangxintuan-heigu (LTH) i ddH2O 3 d eller Blötlägg ca 50 frön av korn (Hordeum vulgare cv Golden lovar) i ddH2O för ca 1 d.
- Linda in frön av ris eller korn i fuktig kompress och gror dem på fuktig filterpapper i cirka 30 petriskålar med en diameter på 10 x 10 cm vid 28 ° C. Ris utsäde grobarhet tid är ca 2-3 d, korn utsäde grobarhet tid är ca 2 d. Den relativa luftfuktigheten i växthuset är cirka 70%.
- Plantera plantorna av ris eller korn i krukor med hjälp av Ånghärdad krukväxtjord och vattning och sedan täcka dem med ett lager av vermikulit.
- Placera växterna i en lämplig glasshouse eller tillväxt skåp vid 25 ° C i ca 1 ~ 2 veckor.
- Skär 3 lager filtrerpapper i cirklar med sterila kirurgiska saxar (varje cirkel har en 8 cm i diameter) och placera dem på 100 mm steril plast tallrikar.
- Lägga till ddH2O varje maträtt i blöt pappersfiltret.
- Se till att pappersfiltret är helt våt men lägga till någon extra vatten.
- Ta bort eventuellt överflödigt vatten med en vakuumpump.
- Plats 2 sterila tandpetare i kultur skålen att stödja ris/kornet löv; utrymme tandpetare ~ 2-3 cm mellanrum.
- Samla in bladen av riset 2 veckor efter de frön eller ta bladen av korn 7 d efter de frön.
- Använder 4 - till 6-blad plantor av ris/korn, skär den nedre delen av stjälken på ~ 5 cm från toppen och samla in bladen.
-
Spray inympning protokoll
- Kultur-svamp påfrestningen på OTA plattor i en termostatisk inkubator (25 ° C) för ~ 4 d.
- Tillsätt ~ 2 mL ddH2O använda en 0,5 - 5 mL pipett till varje 4-dag-gammal tallrik.
- Med en inympning loop, skrapa mycelia M. familjen vildtyps-stammen och en mutant stam i mycelia skräp.
- Samla mycelia skräp och överföra den till en ny OTA-platta. Ta mycelia skräp och föna som i ren bänk.
- Täcka plattan med 3 lager av gasväv att säkerställa den luftfuktighet som krävs för tillväxt av conidia i ett växthus vid 25 ° C på dagen (14 h) och 23 ° C på natten (10 h) för 24-48 h.
- Tillsätt 2 mL av ddH2O till varje maträtt och skrapa conidia försiktigt med sterila tops följt av en filtrering genom 2 lager lins papper. Var noga med att inte skrapa på ytan av odlingssubstratet.
- Över conidia till en ny 50 mL tub med en 100-1000 µL pipett.
- Centrifugera under 5 minuter vid minst 5 000 x g vid 25 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten för att ge 2 x 104 conidia per mL i en 0,025% (v/v) Tween-20 lösning. Tween-20 lösningen är vanligen ca 10-20 mL.
- Häll sporvattnet i en handhållen spruta.
- Spay ca 10 mL av conidial upphängning på ris bladen 2-vecka-gammal ris plantor eller korn blad 7-dag-gammal korn plantor och inkubera dem vid 25 ° C i en mörk, fuktig kammare för ~ 24 h. Spray kontroll växterna med 0,025% (v/v) Tween-20 lösning.
- Överföra bladen till en annan fuktig kammare under fluorescerande ljus vid 25 ° C för en fotoperiod 12 h.
- Spela in sjukdomssymtomen på 5 d efter inympningen. Undersöka sjuka ris/korn bladen ~ 6 cm långa. Utvärderingen standard är enligt poängsystem för blast motstånd av den internationella Rice Research Institute (IRRI). Detaljerna i systemet för poängberäkning för blast resistens visas i tabell 1.
- Fotografera bladen att utvärdera infektionen av de testa stammarna. Infektionen bedömdes av antalet lesioner per 3,6 cm2.
2. såra inympning med mycel kuber eller droppar av Conidial upphävande av M. länkar
- Med hjälp av en anatomisk nål, skrapa tre 2-3 cm långa sår i de viktigaste venerna i fristående ris/korn blad; Se till att inte penetrera bladen.
- Sätt skrapade bladen på tandpetare och spraya en 0,02% (v/v) Tween-20 lösning på bladen bildar ett lager av droppar.
- Skär en 0.5 x 0.5 cm mycelial plugg för varje M. familjen stam (vildtyp, mutant, komplement stammar, eller andra test stammar) från en OTA-plattan.
- Sätta de mycelial pluggarna eller 25 µL droppar conidial suspension på sårade lämnar och inkubera bladen vid 25 ° C i en fuktig kammare för 3-8 d.
- Undersöka lesionerna på 5-7 d efter inympningen. Metoden för undersökningen är samma som det var för den spray inokuleringsmetod (se steg 1.3.13).
- Undersöka sjuka ris/korn blad av ~ 6 cm i längd och fotografera dem för att utvärdera infektionen av de testa stammarna. Infektionen bedömdes av antalet lesioner per 3,6 cm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hela arbetsflödet för tekniken visas i figur 1. Anläggningen infektion analyserna utfördes på 14 dagar gamla mottagliga ris plantor (O. sativa cv CO-39) eller mottagliga 7-dag-gammal korn lämnar (H. vulgare cv Golden lovar)7,8,9. För att testa för en infektion på ris bladen, en conidial suspension (1,0 x 105 sporer/mL) av M. familjen vildtyp stammen P131 och den Com1 radering mutant stammen preparerades och sedan sprayas på de blad slidor av de 14 dagar gammalt mottagliga CO-39 plantor, som förvarades sedan i en fuktig kammare för 5 d10. Den P131-inokuleras CO-39 lämnar visas de typiska robust lesionerna av ris blast, men Com1-inokulerade bladen visade uppenbar infektion defekter och kan inte framkalla en full infektion (figur 2A). Vildtyp stammen P131 är en stam som erhållits genom du-Liang Peng i 198818. MoKMT2H null mutant (ΔMoKMT2H) erhölls av Cao et al. i vårt labb med hjälp av en target gen ersättare strategi11. Com1 mutant isolerades av Yang et al. i du-Liang Peng's lab10.
För att kontrollera om den M. familjen ΔMoKMT2H kunde infektera värdceller genom sår, skadad bladen av vildtyp ris växter var inokuleras med mycelial pluggar av ΔMoKMT2H via metoden spray eller skadade metod11. De blad som var spray-inokuleras med ΔMoKMT2H visade inga uppenbara brister i ΔMoKMT2H infektion jämfört med P131/vildtyps-stam; dock observerades uppenbara brister för bladen som inokulerats med ΔMoKMT2H via sår (figur 2A). Att ytterligare testa anläggningen infektion med korn blad, frisk eller skadade blad (cv Golden lovar) var inokuleras med conidial droppar eller mycelial pluggar, respektive, Com1, ΔMoKMT2Heller P131. På 5 d efter inympningen, hade typiska ris blast lesioner fullt utvecklad på bladen inokuleras med antingen ΔMoKMT2H eller P131 stam, medan färre och mindre lesioner hittades på bladen inokuleras med Com1 mutant (figur 2 B).
Figur 1 : Ett system som illustrerar växt infektion. Frön har grott i jord i plastkrukor (50 mm2 x 50 mm djup, med ett dränage hål), två frön per kruka och plantorna var odlas i ett växthus. Kultur och vaccinationer av blast svampen M. familjen odlades på OTA tallrikar. För de conidia sprutning inokuleringsmetod, var conidia fjädringen upphängd i en 0,02% (v/v) Tween-20 lösning och sprayas på ris/korn växterna. För den repade inokuleringsmetod, skrapade ris/korn växten bladen sattes på plasttallrikar och sedan inokuleras av en mycelial plugg eller conidia suspensionen. Och sedan alla behandlat växtblad var mörk-odlade för 24 h och ljus-odlade för 12 h. Slutligen, antalet kolonier inom enheter av 3,6 cm2 spelades in. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Com1 och MoKMT2H krävs för en conidium bildning och patogenicitet ris blad. (A) i denna panel visas inympning av ris lämnar via conidia spray (vänster) eller mycelial plug (höger) med conidia från den M. familjen vildtyp P131, mutant Com1eller ΔMoKMT2H. Typiska bladen observerades 7 d efter mycelial plug-medierad inympningen, som genomfördes på skadad ris bladen. Typiska lesioner observerades 5 d efter mycelial plug-medierad inympningen. (B) korn bladen var inokuleras via conidia spray (vänster) eller mycelial plug (höger). Som håna behandling kontroll sprutades samma volym av en 0,025% (v/v) Tween-20 lösning. För såret inympningen, har figurera av P131 ändrats från Cao et al. 11. den MoKMT2H i ascomycete svamparna är en funktionell homolog av Ash1, som är inblandad i H3K4 och H3K36 metylering11. Bar = 1 cm. Δcom1 mutanter betydligt i virulens på ris och korn plantor10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Skala | Beskrivning |
| 1 | Små bruna fläckar av pin-point storlek |
| 2 | Små trint till något långsträckt, nekrotisk grå fläckar, ca 1-2 mm i diameter, med en distinkt brun marginal. Lesioner finns främst på övre bladen |
| 3 | Lesion typ är samma som 2, men betydande antal lesionen är på theupper blad |
| 4 | Typiska mottagliga blast lesioner, 3 mm eller längre, smittar mindre än 4% av theleaf område |
| 5 | Typiska mottagliga blast lesioner, 3 mm eller längre, smittar mindre än 4-10% av området blad |
| 6 | Typiska mottagliga blast lesioner, 3 mm eller längre, smittar mindre än 11-25% av området blad |
| 7 | Typiska mottagliga blast lesioner, 3 mm eller längre, smittar mindre än 26-50% av området blad |
| 8 | Typiska mottagliga blast lesioner, 3 mm eller längre, smittar mindre än 51-75% av området blad, många lämnar döda |
| 9 | Typiska mottagliga blast lesioner, 3 mm eller längre, infektera mer än 75% av området blad |
Tabell 1: ett poängsystem för blast motstånd. Tabellen är domen från den internationella Rice Research Institute (IRRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anläggningen sjukdomsgener motstånd har en viktig roll i att förebygga infektioner av patogener, inklusive svamp patogener1,12. Ris blast har använts som en modell att förstå vilken typ av patogen befolkningen strukturerar och identifiera växten motstånd gener4. Därför är det nödvändigt att undersöka sjukdom resistens genotyp och avirulence genotyper av de viktigaste sorterna av jordbrukets växter i stor skala att identifiera sjukdomsresistenta växter som kan odlas kontinuerligt. Dessutom nödvändiggör fördelarna med avirulence genotyper av fältet patogener den rationella fördelningen av de olika resistenta genotyperna värd sorter12,13. Nuvarande metoder för inympning störa dock vanligen screening för motstånd och patogen identifiering14,15,16,17.
Här presenterar vi en snabb och noggrann metod att testa anläggningen infektion. Detta inokuleringsmetod är lämplig för identifiering av resistenta växter under avel prövningar och av fenotypen av en avkomma befolkning under kloning av antibiotikaresistensgener. Här etablerade vi en metod för ympning sårade växt lämnar med M. länkar. Eftersom värd motståndet spelar en viktig roll i att förebygga spridning av patogener, denna in vitro- Metod, som producerade sår på testade ris lämnar och inokuleras ris explosionen på såret, är praktiskt för att skapa en infektion direkt i bladen utan att behöva tränga leaf epidermis och epidermal cellväggen. Dessutom är denna inokuleringsmetod passar olika blad åldrar. Inympning resultaten är stabil och noggrann. Metoden för sårande inympningen kan användas för inympning med mycelia för att identifiera patogeniteten svamp stammar som producerar endast låga mängder conidia.
Detta protokoll kommer att ytterligare bidra till vår förståelse av de patogena mekanismer som är bevarad i svampar, liksom de patogen-specifika faktorer som tillåter en svamp att motstå och undertrycka den medfödda immuniteten för dess värd13. Såret inympningen gäller dock inte när man försöker fastställa vilken en conidial invasion och mycelia expansion. Men i naturligt tillstånd, kan metoden spray inympning bättre spegla patogeniteten av en patogen. Spray inympning metoden är lätt att använda och hjälper till att förbättra arbetseffektivitet. Dessa resultat tyder på en noggrann och stabil inokuleringsmetod är nödvändiga för screening sammantaget och plantera antibiotikaresistensgener och bestämma patogenicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av särskilda vetenskapliga forskningsprojektet vid Beijing jordbruket universitetet (YQ201603) och det vetenskapliga projektet i Beijing pedagogiska kommittén (KM201610020005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401 (2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430 (2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
