इन विट्रो आंत मेजबान-सूक्ष्म जीव इंटरफेस पर एक सिंथेटिक बैक्टीरियल कंसोर्टियम की व्यवहार्यता का आकलन
Summary
आंत मेजबान-सूक्ष्म जीव बातचीत एक उपंयास एक सिंथेटिक मौखिक समुदाय के संयोजन दृष्टिकोण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया, इन विट्रो जठरांत्र पाचन में , और छोटी आंत उपकला का एक मॉडल । हम एक तरीका है कि रोगजनकों और बहु प्रजातियों के सेल आक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है वर्तमान फिल्म, या यहां तक कि प्रोबायोटिक योगों के जीवित रहने का परीक्षण करने के लिए ।
Abstract
मेजबान और microbiota के बीच एक साथ खेलना लंबे समय से मांयता प्राप्त है और बड़े पैमाने पर वर्णित है । मुंह जठरांत्र संबंधी मार्ग के अंय वर्गों के समान है, के रूप में निवासी microbiota होता है और exogenous जीवाणुओं द्वारा colonisation रोकता है । वास्तव में, बैक्टीरिया की ६०० से अधिक प्रजातियों मौखिक गुहा में पाए जाते हैं, और एक एकल व्यक्ति के चारों ओर ले जा सकते है १०० किसी भी समय अलग । मौखिक जीवाणु मौखिक पारिस्थितिकी तंत्र में विभिन्न niches का पालन करने की क्षमता के अधिकारी, इस प्रकार निवासी माइक्रोबियल समुदायों के भीतर एकीकृत बनने, और विकास और अस्तित्व के पक्ष में । हालांकि, निगलने के दौरान आंत में बैक्टीरिया का प्रवाह आंत microbiota के संतुलन को परेशान करने के लिए प्रस्तावित किया गया है । वास्तव में, पी gingivalis के मौखिक प्रशासन श्रोणि माइक्रोफ्लोरा में बैक्टीरियल संरचना स्थानांतरित कर दिया । हम प्राकृतिक मौखिक पारिस्थितिकी तंत्र का एक सरलीकृत प्रतिनिधित्व के रूप में एक सिंथेटिक समुदाय का इस्तेमाल किया, स्पष्ट के अस्तित्व और मौखिक जीवाणुओं की व्यवहार्यता अनुकरणीय जठरांत्र पारगमन शर्तों के अधीन । चौदह प्रजातियों का चयन किया गया, इन विट्रो लार, गैस्ट्रिक, और आंत्र पाचन प्रक्रियाओं के अधीन है, और एक multicompartment सेल कएको छैन-2 और HT29-MTX कोशिकाओं युक्त मॉडल के लिए प्रस्तुत करने के लिए आंत श्लैष्मिक उपकला अनुकरण । इस मॉडल को enterohepatic संचलन में शामिल कोशिकाओं पर निगल बैक्टीरिया के प्रभाव को जानने की सेवा की । सिंथेटिक समुदायों का उपयोग नियंत्रण और reproducibility के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, इस पद्धति रोगज़नक़ व्यवहार्यता और बाद में सूजन से जुड़े परिवर्तन, प्रोबायोटिक मिश्रण की औपनिवेशीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और अंततः, प्रणालीगत संचलन पर संभावित जीवाणु प्रभाव ।
Introduction
मनुष्य बैक्टीरिया के साथ cohabit, जो मानव कोशिकाओं के रूप में एक ही नंबर पर मौजूद हैं1. अत: मानव microbiome की व्यापक समझ प्राप्त करना महत्वपूर्ण है । मौखिक गुहा में एक अनूठा वातावरण है कि यह कई छोटे निवास में विभाजित है, इस प्रकार उन विभिंन स्थानों में बैक्टीरिया और फिल्म की एक विशाल विविधता युक्त । एक खुला पारिस्थितिकी तंत्र होने के नाते, मुंह में कुछ प्रजातियों क्षणिक आगंतुकों हो सकता है । हालांकि, कुछ सूक्ष्मजीवों उपनिवेश के बाद जल्द ही जंम और फार्म का आयोजन किया2फिल्म । ये मसूड़ों दरार के ऊपर दांत की सतह में पाए जाते हैं, subgingival दरार, जीभ, श्लैष्मिक सतहों और दंत कृत्रिमता और fillings3। बैक्टीरिया भी दांत नहर के लुमेन में flocs और planktonic कोशिकाओं के रूप में उपस्थित हो सकते हैं, या तो गल लुगदी ऊतक के साथ मिश्रित या एक द्रव चरण में निलंबित कर दिया ।
वहां सक्रिय है, लगातार पार मेजबान कोशिकाओं और निवासी microbiota4के बीच बात करते हैं । बैक्टीरिया के भीतर और प्रजातियों के बीच संवाद, और प्राकृतिक कॉलोनाइजरों का केवल एक छोटा सा अनुपात ऊतकों का पालन कर सकते हैं, जबकि अन्य बैक्टीरिया इन प्राथमिक कॉलोनाइजरों के लिए देते हैं. उदाहरण के लिए, सेल सेल-सूक्ष्मजीवों के बीच बंधन माध्यमिक कॉलोनाइजरों मौखिक में एकीकृत करने के लिए कुंजी है फिल्म, और बातचीत माइक्रोबियल कोशिकाओं4के जटिल नेटवर्क का निर्माण । एक लार नमूने में बैक्टीरियल समुच्चय के लगभग ७०% Porphyromonas एसपी द्वारा गठित कर रहे हैं., स्ट्रेप्टोकोकस सपा., Prevotella सपा., Veillonella सपा., और अज्ञात Bacteroidetes। एफ. के. nucleatum ने दिवंगत कॉलोनाइजरों पी. gingivalis, टी. denticola, और Tannerella forsythia, जो periodontitis5में फंसाया है, के साथ subgingivalी फिल्म और समुच्चय में एक मध्यवर्ती कॉलोनाईजर है. इसके अलावा, स्ट्रेप्टोकोकस mitis दोनों श्लैष्मिक और दंत निवास स्थान पर रह रहे हैं, जबकि एस sanguinis और एस gordonii दांत उपनिवेश को पसंद करते है3। इस प्रकार, एस sanguinis लोअर कृन्तक और कुत्तों में मौजूद है, जबकि Actinomyces naeslundii ऊपरी पूर्वकाल में पाया गया है6।
इसके अलावा स्वदेशी microbiome मानव स्वास्थ्य को बनाए रखने में भूमिका निभाता है2. निवासी microbiota प्रतिरक्षा शिक्षा में भाग लेता है और रोगजनक विस्तार को रोकने में । इस colonisation प्रतिरोध होता है क्योंकि देशी बैक्टीरिया बेहतर सतहों के लिए संलग्न में अनुकूलित किया जा सकता है, और अधिक कुशल विकास के लिए उपलब्ध पोषक तत्वों metabolising पर. हालांकि प्रोबायोटिक उपभेदों जठरांत्र मार्ग जीवित रहने और सक्रिय रहते हैं, जठरांत्र संबंधी मार्ग के एक ऊपरी स्थान से निगल autochthonous बैक्टीरिया के हठ पूरी तरह से वर्णित नहीं किया गया है । इस प्रकार, हम एक कृत्रिम समुदाय, मौखिक पारिस्थितिकी तंत्र के प्रतिनिधि, नकली जठरांत्र पारगमन शर्तों के अधीन । बैक्टीरियल कोशिकाओं की व्यवहार्यता आंत उपकला जैसी एक multicompartment मॉडल का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. वर्तमान आंत सिमुलेटर चमकदार माइक्रोबियल समुदाय7के विश्लेषण के मामले में उपयुक्त reproducibility प्रदान करते हैं । हालांकि, बैक्टीरियल आसंजन और मेजबान सूक्ष्म जीव बातचीत अलग से संबोधित कर रहे हैं, माइक्रोबियल समुदायों के साथ सेल लाइनों के संयोजन के रूप में8चुनौती दे रहा है । इसके विपरीत, हम एक रूपरेखा है कि सफल औपनिवेशीकरण आंत अंतरफलक पर रिपोर्ट की घटनाओं के संभावित यंत्रवत विवरण प्रदान करता है प्रस्तुत करते हैं । दरअसल, इस मॉडल को संयुक्त रूप से एक स्थिर आंत मॉडल के साथ प्रयोग किया जा सकता है मेजबान सतह संकेत पर माइक्रोबियल समुदायों के प्रभाव का मूल्यांकन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ओरल microbiome मानव स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण तत्व के रूप में हाल ही में कई लेखकों द्वारा रिपोर्ट20,21। पिछले निष्कर्षों का सुझाव है कि बैक्टीरिया की बड़ी भार युक्त लार की घूस छोटी आंत क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक आभार Flanders रिसर्च फाउंडेशन से मार्ता Calatayud अर्रोयो (FWO postdoctoral फैलोशिप-12N2815N) के लिए वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । एम्मा Hernandez-Sanabria Flanders इनोवेशन और उद्यमिता (Agentschap voor Innovatie डोर Wetenschap en technologie पर, आईडब् ल् यूटी) द्वारा समर्थित एक postdoctoral फेलो है ।
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
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