Оценка жизнеспособности синтетических бактерий консорциума на интерфейсе в Vitro хост микробов кишечника
Summary
Гут хост микробных взаимодействий были оценены с использованием новаторский подход, сочетая синтетических устные сообщества, в пробирке желудочно-кишечного пищеварения и модель эпителия тонкой кишки. Мы представляем метод, который может быть адаптирован для оценки клеток вторжение патогенов и многовидового биопленки, или даже для тестирования, живучести составов пробиотик.
Abstract
Взаимодействие между принимающей и микробиоты давно признали и подробно описано. Рот похож на других разделах желудочно-кишечного тракта, как резидентов микробиоты происходит и предотвращает колонизация внешних бактериями. Действительно более чем 600 видов бактерий находятся в полости рта, и один человек может нести около 100 различных в любое время. Устные бактерии обладают способностью придерживаться различных ниш в устной экосистеме, таким образом став интегрированы в резидентов микробных сообществ и пользу роста и выживания. Однако поток бактерий в кишечнике во время глотания предложил нарушить равновесие кишка микробиоты. В самом деле пероральный P. амёба смещается бактериальный состав в подвздошной микрофлоры. Мы использовали синтетический сообщества как упрощенное представление природной Устные экосистемы, для выяснения выживания и жизнеспособности бактерий полости рта, в условиях имитации желудочно-кишечного транзита. Четырнадцать видов были отобраны, подвергается в vitro слюнных, желудочного и кишечного пищеварения процессы и представлены многосредовой ячеечная модель, содержащих Како-2 и HT29-MTX клетки для имитации эпителии слизистой кишки. Эта модель служил разгадать влияние проглатывания бактерий на клеток, участвующих в энтерогепатической циркуляции. Использование синтетических сообществ позволяет управляемость и воспроизводимость. Таким образом эта методология может быть адаптирована к оценке жизнеспособности возбудителя и последующие изменения связанных воспаление, колонизации потенциала пробиотик смесей, и в конечном счете, потенциальные бактериальных воздействия на пресистемной циркуляции.
Introduction
Люди сожительствовать с бактериями, которые присутствуют на столько же, сколько клеток человека1. Следовательно важно из важнейших для получения всестороннего понимания человеческого микрофлора. Полости представляет собой уникальную среду, в том, что оно разделено в несколько меньших обитания, таким образом, содержащего большое разнообразие бактерий и биопленки в этих разных местах. Будучи открытой экосистемы, некоторые виды во рту могут быть временные посетителей. Однако некоторые микроорганизмы колонизировать вскоре после рождения и формы организованной биоплёнки2. Они встречаются на поверхности зубов выше десневая щель, поддесневых щелевая, язык, слизистой поверхности и протезирования зубов и пломб3. Бактерии могут также присутствовать как хлопьев и планктонные клеток в просвет канала зуба, вперемешку с некротическими целлюлозы ткани или приостановлено в жидкой фазы.
Существует активная, непрерывной перекрестных помех между клетки хозяина и резидентов микробиоты4. Бактерии общаться внутри и между видами, и лишь небольшая часть природного колонизаторов может придерживаться тканей, в то время как другие бактерии придают этим основным колонизаторов. Например привязки ячеек между микроорганизмов является ключевым для интеграции вторичных колонизаторов в устной биопленки и сложных сетей взаимодействия микробной клетки4. Около 70% бактерий агрегатов в образец слюны формируются Porphyromonas sp., Streptococcus sp., процессы sp., Veillonella sp. и неизвестными Bacteroidetes. F. nucleatum является промежуточным колонизатором в поддесневой биопленки и агрегатов с конца колонизаторов P. амёба, т. denticola и Tannerella Форсития, которые замешаны в пародонтит5. Кроме того Streptococcus mitis занимает слизистых оболочек и стоматологическая местообитаний, а S. sanguinis и S. gordonii предпочитают колонизировать зубы3. Таким образом, S. sanguinis присутствует в нижних резцов и клыков, а Actinomyces naeslundii были обнаружены в верхнем вестибуларный6.
Кроме того коренные микрофлора играет роль в поддержании здоровья человека2. -Резидентов микробиоты участвует в иммунной системе образования и в предотвращении расширения патогена. Это сопротивление колонизация происходит потому что родной бактерии могут быть лучше адаптированы на прикрепление к поверхности и более эффективным в метаболизирующих доступные питательные вещества для роста. Хотя пробиотических штаммов выживают желудочно-кишечного тракта и остаются активными, сохранения автохтонных бактерий, проглотил из верхнего расположения желудочно-кишечного тракта не был полностью описан. Таким образом мы подвергнуты искусственный сообщества, представитель устные экосистемы, имитируемых желудочно-кишечного транзита условий. Жизнеспособность бактериальных клеток была оценена с помощью многосредовой модели, напоминающие эпителии кишечника. Текущий кишки тренажеры предлагают подходящие воспроизводимость результатов с точки зрения анализа Люминал микробной сообщества7. Однако бактериальной адгезии и хост Микроб взаимодействия отдельно рассматриваются, как сочетание клеточных линий с микробных сообществ является сложной задачей8. Напротив мы представляем основы, которая обеспечивает потенциальные механистическое объяснение событий успешной колонизации, сообщили о кишечнике интерфейс. Действительно эта модель может совместно использоваться с моделью статическое кишки для оценки воздействия микробных сообществ на хост поверхности сигнализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Устные микрофлора является ключевым элементом в здоровье человека, как недавно сообщили несколько авторов20,21. Предыдущие результаты показывают, что проглатывание слюны, содержащих большие нагрузки бактерий может повлиять на микробные экосистемы тонко…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы с благодарностью признаем финансовую поддержку от Фонда исследований Фландрии Marta Calatayud Арройо (докторантура стипендий FWO-12N2815N). Эмма Эрнандес-Санабриа – Докторантура научный поддерживаемых Фландрии инноваций и предпринимательства (Agentschap voor Innovatie двери Wetenschap en Technologie, ВВТ).
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al., Verhoeckx, K., et al. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
