Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut
Summary
Interazioni ospite-microbo intestino sono stati valutati utilizzando un approccio innovativo che unisce una comunità orale sintetica, la digestione gastrointestinale in vitro e un modello dell’epitelio dell’intestino tenue. Presentiamo un metodo che può essere adattato per valutare l’invasione delle cellule degli agenti patogeni e multispecie biofilm, o anche per testare la capacità di sopravvivenza dei probiotici formulazioni.
Abstract
L’interazione tra host e microbiota è stato a lungo riconosciuto e ampiamente descritto. La bocca è simile ad altre sezioni del tratto gastrointestinale, come microbiota residente si verifica e impedisce la colonizzazione di batteri esogeni. Infatti, più di 600 specie di batteri si trovano nella cavità orale, e un singolo individuo può trasportare circa 100 diversi in qualsiasi momento. I batteri orali possiedono la capacità di aderire alle varie nicchie nell’ecosistema orale, così diventando integrato all’interno della comunità microbica residente e favorire crescita e sopravvivenza. Tuttavia, il flusso di batteri nell’intestino durante la deglutizione è stato proposto a perturbare l’equilibrio del microbiota. Infatti, la somministrazione orale di p. gingivalis spostato composizione batterica nella microflora ileale. Abbiamo usato una comunità sintetica come una rappresentazione semplificata dell’ecosistema naturale orale, per delucidare la sopravvivenza e la vitalità dei batteri orali sottoposti a condizioni di transito gastrointestinale simulata. Quattordici specie sono stati selezionati, sottoposti in vitro salivare, gastrica e processi di digestione intestinale e presentati a un modello di vari compartimenti cellulari contenenti cellule Caco-2 e HT29-MTX per simulare l’epitelio della mucosa intestinale. Questo modello ha servito a svelare l’impatto di ingestione batteri su cellule coinvolte nella circolazione enteroepatica. Uso delle Comunità di sintetiche permette di controllabilità e riproducibilità. Così, questa metodologia può essere adattata per valutare la vitalità del patogeno e successive modifiche associate all’infiammazione, capacità di colonizzazione delle miscele di probiotici, e in ultima analisi, batterico potenziale impatto sulla circolazione presistemica.
Introduction
Gli esseri umani convivono con i batteri, che sono presenti presso lo stesso numero di cellule umane1. Quindi, è di fondamentale importante ottenere una comprensione globale del microbioma umano. La cavità orale è un ambiente unico, in quanto è diviso in parecchi più piccoli habitat, contenendo così una grande varietà di batteri e biofilm in quei luoghi diversi. Essendo un ecosistema aperto, alcune specie in bocca può essere transitori visitatori. Tuttavia, alcuni microrganismi colonizzano presto dopo la nascita e forma organizzata biofilm2. Questi si trovano sulla superficie dei denti sopra il crepaccio gengiva, subgingival interstiziale, linguetta, superfici mucose e protesi dentali e materiali da otturazione3. I batteri possono essere presenti anche come flocculi e cellule planctoniche nel lume del canale del dente, intervallate da tessuto della polpa necrotica o sospeso in una fase fluida.
C’è attivo, continuo cross-talk tra cellule dell’ospite e il microbiota residente4. Batteri comunicano all’interno e tra le specie, e solo una piccola percentuale dei colonizzatori naturale possa aderire ai tessuti, mentre altri batteri allegare Questi colonizzatori primari. Per esempio, l’associazione di cella tra microrganismi è essenziale per integrare colonizzatori secondari nel biofilm orali e costruzione di reti complesse di interazione cellule microbiche4. Circa il 70% degli aggregati batterici in un campione di saliva sono formate da Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP., Veillonella SP. e non identificato Bacteroidetes. F. nucleatum è un colonizzatore intermedio nel biofilm subgengivale e aggregati con i colonizzatori tardi gingivalis del p., T. denticola e Tannerella forsythia, che sono implicati in periodontitis5. In più, Streptococcus mitis occupa habitat sia mucoso e dentale, mentre S. sanguinis e S. gordonii preferiscono colonizzare denti3. Così, S. sanguinis è presente in incisivi inferiori e canini, mentre Actinomyces naeslundii è stato trovato in anteriori superiore6.
Inoltre, il microbioma indigeno svolge un ruolo nel mantenimento della salute umana2. Microbiota residente partecipa alla formazione immune e nell’impedire l’espansione di agente patogeno. Questa resistenza di colonizzazione si verifica perché i batteri nativi possono essere meglio adattati al fissaggio su superfici e più efficienti a metabolizza le sostanze nutritive disponibili per la crescita. Sebbene ceppi probiotici sopravvivono al passare gastrointestinale e rimangono attive, la persistenza di batteri autoctoni inghiottito da una posizione superiore del tratto gastrointestinale non è stato completamente descritto. Così, abbiamo sottoposto una comunità artificiale, rappresentante dell’ecosistema orale, alle condizioni di transito gastrointestinale simulata. Attuabilità delle cellule batteriche è stata valutata utilizzando un modello multicomparto che assomiglia l’epitelio intestinale. Simulatori di intestino attuale offrono riproducibilità adatto in termini di analisi della comunità microbica luminal7. Tuttavia, adesione batterica e l’interazione ospite-microbo separatamente sono indirizzate, come combinazione di linee cellulari con comunità microbiche è impegnativo8. Al contrario, vi presentiamo un quadro che fornisce spiegazione meccanicistica potenziale di colonizzazione successo eventi segnalati sull’interfaccia dell’intestino. Infatti, questo modello può essere congiuntamente utilizzato con un modello statico dell’intestino per valutare l’impatto delle comunità microbiche su host superficie segnalazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il microbioma orale è un elemento chiave nella salute umana, come recentemente riportato da diversi autori20,21. I risultati precedenti suggeriscono che l’ingestione di saliva che contiene grandi carichi di batteri può influenzare l’ecosistema microbico dell’intestino tenue, che è uno dei principali siti per l’adescamento immune. La combinazione di un modello statico di digestione gastrointestinale superiore con l’interfaccia host rappresentato dalle cellule e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario della Fondazione di ricerca Fiandre a Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria è un postdoctoral fellow supportato da Flanders innovazione e imprenditorialità (Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie, IWT).
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al., Verhoeckx, K., et al. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
