Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut
Summary
Interações do anfitrião-micróbio de intestino foram avaliadas usando uma nova abordagem que combina uma comunidade oral sintética, em vitro digestão gastrointestinal e um modelo do epitélio do intestino delgado. Apresentamos um método que pode ser adaptado para avaliar a invasão celular dos micróbios patogénicos e biofilmes de várias espécies, ou mesmo para testar a capacidade de sobrevivência dos probióticos formulações.
Abstract
A interação entre o host e microbiota tem sido reconhecida por muito tempo e extensivamente descrita. A boca é semelhante a outras seções do tracto gastrointestinal, como microbiota residente ocorre e evita a colonização por bactérias exógenas. Com efeito, mais de 600 espécies de bactérias são encontradas na cavidade oral, e um único indivíduo pode transportar cerca de 100 diferentes a qualquer momento. Bactérias orais possuem a capacidade de aderir aos diversos nichos do ecossistema oral, assim, tornando-se integrados dentro dos residentes das comunidades microbianas e favorecem crescimento e sobrevivência. No entanto, o fluxo de bactérias no intestino durante a deglutição tem sido proposto para perturbar o equilíbrio da microbiota do intestino. Na verdade, a administração oral de p. gingivalis mudou a composição bacteriana na microflora ileal. Éramos uma comunidade sintética como uma representação simplificada do ecossistema natural oral, para elucidar a sobrevivência e viabilidade de bactérias orais, sujeitado a condições de trânsito gastrointestinal simulado. Catorze espécies foram selecionados, submetidos a em vitro salivar, gástrica e processos de digestão intestinal e apresentou um modelo de célula multicompartment contendo células Caco-2 e HT29-MTX para simular o epitélio da mucosa do intestino. Este modelo serviu para desvendar o impacto das bactérias engolidos em células envolvidas na circulação entero-hepática. Usar comunidades sintéticas permite a controlabilidade e reprodutibilidade. Assim, esta metodologia pode ser adaptada para avaliar a viabilidade do agente patogénico e inflamação associada as alterações subsequentes, capacidade de colonização de probiótico misturas, e em última análise, bacteriana potencial impacto sobre a circulação pré-sistêmico.
Introduction
Os seres humanos convivem com as bactérias, que estão presentes no mesmo número de células humanas1. Portanto, é de crucial importante obter uma compreensão abrangente da microbiome humano. A cavidade oral é um ambiente único, em que é dividido em vários habitats menores, assim, que contém uma grande variedade de bactérias e biofilmes nesses locais diferentes. Um ecossistema aberto, algumas espécies na boca podem ser transitórios visitantes. No entanto, certos microorganismos colonizam logo após o nascimento e a forma organizaram de biofilmes2. Estes são encontrados na superfície de dentes acima a fenda gengival, o bico subgengival, língua, mucosas e próteses dentárias e recheios3. Bactérias podem também estar presentes como flocos e células planctônicas no lúmen do canal do dente, ou misturado com o tecido pulpar necrótico ou suspensas em uma fluido fase.
Não há ativo, contínuo-conversas cruzadas entre células hospedeiras e a microbiota residente4. Bactérias se comunicar dentro e entre espécies, e apenas uma pequena proporção dos colonizadores naturais pode aderir aos tecidos, enquanto outras bactérias anexar a estes colonizadores primários. Por exemplo, ligação de celular entre microorganismos é chave para a integração de colonizadores secundários em biofilmes orais e construção de redes complexas de interação de células microbianas4. Cerca de 70% dos agregados de bactérias em uma amostra de saliva são formadas por Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP., Veillonella SP. e não identificado Bacteroidetes. F. nucleatum é um colonizador intermediário no biofilme subgengival e agregados com os colonizadores tarde p. gingivalis, T. denticola e Tannerella forsythia, que estão implicados na periodontite5. Além disso, Streptococcus mitis ocupa habitats da mucosa e dentais, enquanto S. sanguinis e S. gordonii preferem colonizam dentes3. Assim, S. sanguinis está presente em menor incisivos e caninos, enquanto Actinomyces naeslundii foi encontrado em VITAPAN superior6.
Além disso, o indígena microbiome desempenha um papel na manutenção da saúde humana2. Microbiota residente participa educação imune e na prevenção da expansão do patógeno. Esta resistência de colonização ocorre porque as bactérias nativas podem estar melhor adaptado ao anexar às superfícies e mais eficiente em metabolizar os nutrientes disponíveis para o crescimento. Embora cepas probióticas sobrevivem a passagem gastrointestinal e permanecem ativas, a persistência de bactérias autóctones engolida de uma posição superior do trato gastrintestinal não foi totalmente descrita. Assim, estamos sujeitos a uma comunidade artificial, representante do ecossistema oral, às condições de trânsito gastrointestinal simulado. Viabilidade das células bacterianas foi avaliada usando um modelo multicompartment parecido com o epitélio do intestino. Simuladores de intestino atual oferecem reprodutibilidade adequada em termos de análise da comunidade microbiana luminal7. No entanto, adesão bacteriana e interação do anfitrião-micróbio separadamente destinam-se, como combinar linhas celulares com comunidades microbianas é um desafio8. Em contrapartida, apresentamos um quadro que apresenta potencial explicação mecanicista de colonização bem sucedidos eventos relatados na interface do intestino. Com efeito, este modelo pode ser usado em conjunto com um modelo de intestino estático para avaliar o impacto das comunidades microbianas na sinalização superfície do hospedeiro.
Protocol
Representative Results
Discussion
A microbiome oral é um elemento chave na saúde humana, como recentemente relatado por vários autores20,21. Conclusões anteriores sugerem que a ingestão de saliva contendo grandes cargas de bactérias pode influenciar o ecossistema microbiano do intestino delgado, que é um dos principais locais para a ferragem imune. A combinação de um modelo estático digestão gastrointestinal superior com a interface de host, representado pelas células epiteliais e sec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem com gratidão apoio financeiro da Fundação de pesquisa de Flandres para Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria é um pós-doutorado apoiado por Flandres inovação e empreendedorismo (Agentschap voor Innovatie porta Wetenschap en Technologie, navegação fluvial).
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
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