فحص الخلوي على أساس تدفق لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا في Myocytes القلب بعد نقص/ريوكسيجينيشن
Summary
نقدم هنا، هو بروتوكول يستخدم صبغ جيمي كارتر-1 لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الخلايا بعد التعرض لنقص/ريوكسيجينيشن مع أو بدون عامل واقية.
Abstract
ضخه في الوقت المناسب والفعال للشريان التاجي المغطى أفضل استراتيجية لتقليل حجم احتشاء عضلة القلب في المرضى الذين يعانون من قطعة ST مرتفعة احتشاء عضلة القلب. ومع ذلك، ضخه في حد ذاته يمكن أن يؤدي إلى الوفاة كارديوميوسيتي كذلك، ظاهرة المعروفة باسم الإصابة ضخه. فتح المسام الانتقال نفاذية المتقدرية (mPTP)، مع انخفاض للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP)، أو depolarization الميتوكوندريا، معترف به عالمياً كخطوة نهائية للإصابة ضخه وهي المسؤولة عن الميتوكوندريا والموت كارديوميوسيتي. جيمي كارتر-1 هو صبغة محبتين الموجبة التي تتراكم في الميتوكوندريا استناداً إلى قيمة نظام التمثيل التناسبي المختلط. أعلى نظام التمثيل التناسبي المختلط، كلما تتراكم JC-1 في الميتوكوندريا. يمكن أن تنعكس كميات متزايدة من JC-1 في الميتوكوندريا بانتقال انبعاث الأسفار من الأخضر (~ 530 نانومتر) إلى اللون الأحمر (~ 590 nm). ولذلك، يمكن أن تشير إلى الحد نسبة كثافة ومضان أحمر/أخضر ديبولاريزيشن الميتوكوندريا. ونحن هنا، نلقي الاستفادة من JC-1 لقياس نظام التمثيل التناسبي المختلط، أو فتح mPTP في myocytes القلب البشري بعد نقص/ريوكسيجينيشن، تم الكشف عن طريق التدفق الخلوي.
Introduction
أمراض القلب والشرايين هو السبب الرئيسي للوفاة في العالم. العلاج الأمثل للحد من الإصابات الدماغية، والحد من حجم احتشاء في المرضى الذين يعانون من ش-الجزء رفع احتشاء عضلة القلب يتم ضخه احتشاء عضلة القلب في الوقت المناسب والفعال عن طريق التدخل التاجي عن طريق الجلد الأولية (PCI)1، 2. ومع ذلك، ضخه تسبب ضررا إضافيا، التي يمكن أن تصل إلى 30 في المئة من حجم احتشاء النهائي3. من المسلم به عالمياً أن المسام الانتقال نفاذية المتقدرية (mPTP) ليس فقط المركزية في المتقدرية الأضرار وخلية الموت أثناء الاسكيمية/ضخه (أنا/R)، بل أيضا هدف متقاربة من كارديوبروتيكتيفي مما يشير إلى4 , 5-كما سوف يحقق افتتاح mPTP depolarization غشاء الميتوكوندريا الداخلية المحتملة (MMP)4، اكتشفنا افتتاح mPTP استخدام 5، 5، 6، 6-تيتراتشلورو-1، 1، 3، المقايسة 3-إيثيل-إيميداكاربوسيانينيوديدي (JC-1).
والرزن جيمي كارتر-1 هو طريقة سيتوفلوريميتريك أن النوعية والكمية على حد سواء، وأنه تم التحقق من المزيد من خلال تحليل نظام التمثيل التناسبي المختلط على مستوى الميتوكوندريا واحدة6. جيمي كارتر-1 موجود كشكل تجميعي، تدر حمراء للانبعاثات الملونة البرتقالي (590 ± 17.5 nm) في المصفوفة من الميتوكوندريا مع MMP العادي؛ مع فقدان نظام التمثيل التناسبي المختلط، جيمي كارتر-1 يتم تحويلها إلى شكل أحادي التي تعطي ومضان أخضر مع انبعاثات من 530 ± 15 نانومتر. ولذلك، انخفاضا في نسبة كثافة fluorescence الحمر/الخضر يمكن أن تشير إلى الحد من نظام التمثيل التناسبي المختلط في ظروف مثل الاسكيمية/ضخه (أنا/R).
بالإضافة إلى JC-1، درست أيضا نظام التمثيل التناسبي المختلط مع الكاتيونات محبتين نفاذية الغشاء مثل 123 والرودامين و 3, 3-ديهيكسيلوكساديكاربوسيانيني يوديد [DiOC6(3)]. ومع ذلك، بالمقارنة مع هذه المسابر اثنين، جيمي كارتر-1 أكثر موثوقية لتحليل نظام التمثيل التناسبي المختلط. وقد والرودامين 123 حساسية ضعيفة نسبيا (لا سيما في تبريد الوضع7،8) وخصوصية الفقراء. في بعض الأحيان التحول في والرودامين 123 صغيرة جداً لدرجة أنه من الصعب للباحثين أو معدات لمراقبة/كشف. وإلى جانب ذلك، في خلية واحدة، هناك مواقع الربط ميتوكندريا مختلفة والرودامين 123 وحتى أنه قد يكون للأسفار المختلفة الانبعاثات9. لا ينصح DiOC6(3) للكشف عن نظام التمثيل التناسبي المختلط أما كما أنه يتفاعل depolarization غشاء البلازما10مع إحساس مرهف.
ولذلك، هنا نستخدم المقايسة جيمي كارتر-1 لتقييم “نظام التمثيل التناسبي المختلط الموطن” بعد تعرضهم لنقص/ريوكسيجينيشن مع أو بدون عامل واقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم هو بروتوكول يستخدم صبغ جيمي كارتر-1 لتقييم نظام التمثيل التناسبي المختلط الخلايا بعد التعرض “الكشف عن” ر. ح بمقايسة جيمي كارتر-1، ونظام التمثيل التناسبي المختلط خلايا مستقلة عن عوامل مثل حجم الميتوكوندريا والشكل والكثافة التي قد تؤثر على الأسفار مكون واحد إشارات14. ون…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة كانت تدعمها المنح “البحوث الوطنية بالمفتاح” وبرنامج التنمية في الصين (رقم 2017YFC1700503)، “البرنامج الوطني للبحوث الأساسية” (برنامج 973) الصين (No.2012CB518602)، “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (رقم 81370223 ورقم 81573957)، ومؤسسة البحوث الابتكارية لطلاب الدراسات العليا من كلية طب الاتحاد بكين (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
