Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil
Summary
Burada, hipoksi/reoxygenation veya koruyucu bir ajan olmadan maruz sonra hücreleri mitokondrial membran potansiyelini değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Zamanında ve etkin reperfüzyon tehlikesi koroner arter ST segment olan hastalarda miyokard enfarktüsü boyutunu azaltmak için en iyi strateji miyokard infarktüsü yükseltilmiş olduğunu. Ancak, reperfüzyon başına daha fazla cardiomyocyte ölüm, reperfüzyon hasarı bilinen bir olay neden olabilir. Mitokondri zar potansiyel (MMP) azalma veya mitokondrial depolarizasyon, mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP), açılış evrensel reperfüzyon hasarı son adımı olarak kabul ve sorumludur mitokondri ve cardiomyocyte ölüm. JC-1 MMP değerine bağlı olarak mitokondri içinde biriken bir lipofilik katyonik boya var. Yüksek MMP, daha Dizayn Merkezi-1 mitokondri içinde birikir. Mitokondri artan miktarlarda JC-1 yeşil floresans emisyon vardiya tarafından yansıması olabilir (~ 530 nm) kırmızı (~ 590 nm). Bu nedenle, kırmızı/yeşil floresan yoğunluğu oranı azaltma mitokondri depolarizasyon belirtebilirsiniz. Biz MMP ölçmek için Dizayn Merkezi-1 avantajı veya hipoksi/reoxygenation akış sitometresi tarafından tespit edildi sonra insan kardiyak miyositler mPTP açılış al.
Introduction
Koroner kalp hastalığı ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir. İskemik yaralanma azaltmak ve ST-segment olan hastalarda enfarktüsü boyutu sınırlama miyokard infarktüsü yükseltilmiş için seçim zamanında ve etkili miyokardiyal reperfüzyon birincil perkütan koroner girişim (PCI)1üzerinden tedavisidir, 2. Ancak, reperfüzyon son enfarktüsü boyutu3ilâ yüzde 30’hesap ek hasara neden olur. Evrensel mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP) sadece iskemi/reperfüzyon sırasında mitokondrial hasar ve hücre ölümü Central’da değil kabul edilmektedir (ı / R), ama aynı zamanda4 sinyal kardiyoprotektif yakınsak bir hedeftir , 5. mPTP açılış iç mitokondri zar potansiyel (MMP)4depolarizasyon hakkında getirmek gibi tespit ettik 5 ‘ 5 ‘, kullanarak mPTP açılış 6, 6 ‘-Pekala-1, 1, 3, 3 ‘-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) tahlil.
JC-1 tahlil hem nitel hem de nicel bir cytofluorimetric yöntemidir ve bir tek mitokondri6düzeyinde MMP analiz ederek daha da doğrulandı. JC-1 kırmızı turuncu renkli emisyon (590 ± 17.5 nm) matris ile normal MMP mitokondri için verimli bir araya getirilmiş biçimi olarak, var; MMP kaybı ile Dizayn Merkezi-1 salma 530 ± 15 Nm ile yeşil floresans verimleri monomeric forma dönüşür. Bu nedenle, kırmızı/yeşil floresan yoğunluğu oranında bir düşüş MMP azalma iskemi/reperfüzyon gibi koşulları göstergesi olabilir (ben / R).
JC-1 ek olarak, MMP da rodamine 123 ve 3, 3’dihexyloxadicarbocyanine iyodür [DiOC6(3)] gibi membran geçirgen lipofilik katyonlar ile çalışılmıştır. Ancak, bu iki problar için karşılaştırıldığında, JC-1 MMP analiz etmek için daha güvenilirdir. Rodamine 123 (özellikle de modu7,8Şoklama) nispeten yoksul duyarlılık ve zavallı özgüllük vardır. Rodamine 123 vardiyada bazen gözlemlemek/algılamak araştırmacılar veya ekipmanlar için zor kadar küçük. Ayrıca, tek bir hücrede farklı mitokondri bağlayıcı siteleri rodamine 123 için vardır ve bu kadar farklı floresan emisyonları9çok olabilir. MMP algılamak için tavsiye edilmez DiOC6(3) hassas plazma zarı10depolarizasyon için tepki olarak da.
Bu nedenle, burada biz Dizayn Merkezi-1 tahlil HCMs MMP hipoksi/reoxygenation veya koruyucu bir ajan olmadan maruz sonra değerlendirmek için kullanın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, biz H/R. tespit için Dizayn Merkezi-1 tahlil tarafından maruz kalma sonra MMP hücre değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut, hücre MMP mitokondrial boyut, şekil ve tek bileşenli floresans etkileyebilir yoğunluğu gibi faktörlerin bağımsız 14sinyalleri. Sonuç olarak, JC-1 tahlil sonuçlarını görece güvenilirdir. Ayrıca, uygun ve zaman kazandıran JC-1 tahlil gerçekleştirmek için. Bu tahlil malzemeleri ve Kimyasalları için düş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (No. 2017YFC1700503), gelen hibe tarafından desteklenen Ulusal temel araştırma programı (973 programı), Çin (No.2012CB518602), Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (No. 81370223 ve No 81573957) ve öngörüyor yenilikçi Araştırma Vakfı Pekin Birliği Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
