Здесь мы представляем протокол, использующий JC-1 краска оценить потенциал митохондриальной мембраны клеток после воздействия гипоксии/реоксигенацию с или без защитного агента.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Потока на основе цитометрии Assay для измерения митохондриальных мембранный потенциал в культивировании после гипоксии/реоксигенацию
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Своевременное и эффективное реперфузии перекрытых коронарной артерии является лучшей стратегией для уменьшения размера при инфаркте миокарда у больных с ST-сегмента повышенных инфаркт миокарда. Однако реперфузия само по себе может привести к дальнейшей cardiomyocyte смерти, явление, известное как реперфузионных повреждений. Открытие митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP), с уменьшение потенциальных митохондриальной мембраны (СПП), или митохондриальной деполяризации, повсеместно признается в качестве заключительного шага реперфузионных повреждений и отвечает за митохондриальных и смерть cardiomyocyte. JC-1 является липофильных Катионный красителем, который накапливается в митохондрии в зависимости от значения ММП. Выше МЦП, больше JC-1 накапливается в митохондриях. Все большее количество JC-1 в митохондриях могут быть отражены с флуоресцентным выбросов переход от зеленого (~ 530 Нм) красный (~ 590 нм). Таким образом сокращение коэффициента интенсивности флуоресценции красный/зеленый может указывать деполяризации митохондрий. Здесь мы берем преимущество JC-1 для измерения ММП, или открытие mPTP в культивировании человека после гипоксии/реоксигенацию, обнаруживаемых проточной цитометрии.
Введение
Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти во всем мире. Препаратом выбора для уменьшения ишемических повреждений и ограничивая размер infarct у больных с ST-сегмента повышенной инфаркт миокарда является своевременным и эффективным миокарда реперфузии через первичного чрескожного коронарного вмешательства (PCI)1, 2. Однако реперфузия вызывает дополнительные повреждения, которые могут составлять до 30 процентов окончательной инфаркте размер3. Повсеместно признается, что митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP) не только Центральной в митохондриальной смерт....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка реагентов и решения
- Подготовка полного среднего человека культивировании (МСБ) путем добавления 25 мл смеси среднего роста Myocyte дополнение к 500 мл Myocyte среднего роста в соответствии с инструкциями производителя. Хранить при 4 ° C и тепло до 37 ° C перед использованием.
- Приготовляют раствор Tongxinluo (TXL) путем растворения TXL ультрадисперсных порошок в сыворотке крови, глюкоза свободно Дульбекко изменение средних орла (DMEM) и регулировка концентрации TXL до 400 мкг/мл, добавив DMEM (для более подробной информации, см.11). Хранить при 4 ° C и тепло до 37 ° C перед использованием.
- Подготовьте ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Перед выполнением assay JC-1 для оценки изменений ММП, настоятельно рекомендуется, что быть проведены эксперименты для подтверждения условий успешно установленные исследователи. Как показывают результаты цитометрии потока (рис. 2), по сравнению с обычной группой, гипоксии/реоксигенацию (H/R) значительно индуцированного апоптоза МСБ (Annexin V + /PI±), указав, что мы была создана на основе ячеек модель я / R (45.00 ± 2,13% против. 11.50 ± 0,18% в группе обычны.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представляем протокол, использующий JC-1 краска для оценки СПП клеток после подвергнуться Ч/р. обнаружено пробирного JC-1, ММП клеток зависит от таких факторов, как митохондриальных размер, форму и плотность, которые могут повлиять однокомпонентный флуоресценции сигналы14. Следовательно результаты анализа JC-1 относительно надежный. Кроме того это удобно и экономия времени для выполнения анализа JC-1. Этот assay имеет низкие требования для материалов и реагентов, и как правило, она занима.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Это исследование было поддержано гранты национальных ключевых исследований и развития программа Китая (№ 2017YFC1700503), Национальная программа основных исследований (973 программа) Китая (No.2012CB518602), Национальный фонд Китая естественных наук (№ 81370223 и № 81573957) и аспирантов инновационный исследовательский фонд Peking союза медицинского колледжа (2016-1002-01-02).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор для анализа потенциала митохондриальной мембраны с JC-1 | Beyodtime, Китай | C2006 | В наборе есть стоковый раствор JC-1 (200×), стоковый буфер для окрашивания (5×) и CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ультрадисперсный порошок | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Китай | 071201 | |
| Аннексин V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, США | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, США | 11966-025 | |
| Сердечный миоцит человека | Promocell, Германия | C-12810 | |
| Среда для роста миоцитов (SupplementMix) | Promocell, Германия | C-39275 | |
| Среда для роста миоцитов (готовая к использованию) | Promocell, Германия | C-22070 | используется с добавкой для роста миоцитовMix |
| GENbox | BioMé rieux, Marcy l' l' Этуаль, Франция | 96127 | 2,5 л |
| (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL КОМПАНИЯ, INC. , Япония | С-1 | |
| Анаэробный индикатор | BioMé rieux, Marcy l' l' Этуаль, Франция | 96118 | |
| Проточный цитометр | Becton-Dickinson, США | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, США | версия8.0.1 | |
| Образец пробирки | Corning Science, США | 352054 | 12*75 мм |
| PBS | Hyclone, США | SH30256.01 |
Ссылки
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for th....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
