Потока на основе цитометрии Assay для измерения митохондриальных мембранный потенциал в культивировании после гипоксии/реоксигенацию
Summary
Здесь мы представляем протокол, использующий JC-1 краска оценить потенциал митохондриальной мембраны клеток после воздействия гипоксии/реоксигенацию с или без защитного агента.
Abstract
Своевременное и эффективное реперфузии перекрытых коронарной артерии является лучшей стратегией для уменьшения размера при инфаркте миокарда у больных с ST-сегмента повышенных инфаркт миокарда. Однако реперфузия само по себе может привести к дальнейшей cardiomyocyte смерти, явление, известное как реперфузионных повреждений. Открытие митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP), с уменьшение потенциальных митохондриальной мембраны (СПП), или митохондриальной деполяризации, повсеместно признается в качестве заключительного шага реперфузионных повреждений и отвечает за митохондриальных и смерть cardiomyocyte. JC-1 является липофильных Катионный красителем, который накапливается в митохондрии в зависимости от значения ММП. Выше МЦП, больше JC-1 накапливается в митохондриях. Все большее количество JC-1 в митохондриях могут быть отражены с флуоресцентным выбросов переход от зеленого (~ 530 Нм) красный (~ 590 нм). Таким образом сокращение коэффициента интенсивности флуоресценции красный/зеленый может указывать деполяризации митохондрий. Здесь мы берем преимущество JC-1 для измерения ММП, или открытие mPTP в культивировании человека после гипоксии/реоксигенацию, обнаруживаемых проточной цитометрии.
Introduction
Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти во всем мире. Препаратом выбора для уменьшения ишемических повреждений и ограничивая размер infarct у больных с ST-сегмента повышенной инфаркт миокарда является своевременным и эффективным миокарда реперфузии через первичного чрескожного коронарного вмешательства (PCI)1, 2. Однако реперфузия вызывает дополнительные повреждения, которые могут составлять до 30 процентов окончательной инфаркте размер3. Повсеместно признается, что митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP) не только Центральной в митохондриальной смерти повреждения и клетки во время ишемии/реперфузии (I / R), но также сходящихся мишенью кардиопротекторное сигнализации4 , 5. как открытие mPTP принесет деполяризации внутренней митохондриальной мембраны потенциал (СПП)4, мы обнаружили mPTP открытия с помощью 5, 5 ‘, 6, 6 ‘ тетрахлор-1, 1′, 3, 3 ‘ тетраэтил imidacarbocyanineiodide (JC-1) пробирного.
Assay JC-1 является метод cytofluorimetric, который как качественные, так и количественных, и он далее протестирована, анализируя ММП на уровне одной митохондрии6. JC-1 существует в агрегированной форме, уступая красный оранжевый цветные выбросов (590 нм ± 17,5) в матрице митохондрий с обычной СПП; с потерей ММП JC-1 преобразуется в односегментную форму, которая дает зеленый флуоресценции с выбросами 530 нм ± 15. Таким образом, снижение коэффициента интенсивности флуоресценции красный/зеленый может означать сокращение ММП в условиях ишемии/реперфузии (I / R).
В дополнение к JC-1 ММП также были изучены с проницаемой мембраны липофильных катионов как родамин 123 и 3, 3 ‘ dihexyloxadicarbocyanine йодид [DiOC6(3)]. Однако по сравнению с этих двух зондов, JC-1 является более надежным для анализа ММП. Родамин 123 имеет сравнительно бедных чувствительность (особенно в закалки режим7,8) и бедных специфичности. Сдвиг в родамин 123 иногда настолько мала, что это трудно для исследователей или оборудование для обнаружения и наблюдения. Кроме того в отдельной ячейке, есть различные митохондрий привязки сайтов для родамин 123 и так, что оно может иметь различные флуоресценции выбросов9. DiOC6(3) не рекомендуется для обнаружения MMP либо, как он чутко реагирует на деполяризации мембраны плазмы10.
Таким образом здесь мы используем пробирного JC-1 для оценки СПП МСБ после воздействия гипоксии/реоксигенацию с или без защитного агента.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем протокол, использующий JC-1 краска для оценки СПП клеток после подвергнуться Ч/р. обнаружено пробирного JC-1, ММП клеток зависит от таких факторов, как митохондриальных размер, форму и плотность, которые могут повлиять однокомпонентный флуоресценции сигналы<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано гранты национальных ключевых исследований и развития программа Китая (№ 2017YFC1700503), Национальная программа основных исследований (973 программа) Китая (No.2012CB518602), Национальный фонд Китая естественных наук (№ 81370223 и № 81573957) и аспирантов инновационный исследовательский фонд Peking союза медицинского колледжа (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
