हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन के बाद कार्डियक Myocytes में Mitochondrial झिल्ली की क्षमता को मापने के लिए एक प्रवाह Cytometry-आधारित परख
Summary
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल का उपयोग करता है कि जे-1 डाई के साथ या एक सुरक्षात्मक एजेंट के बिना हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन के उजागर होने के बाद कोशिकाओं की mitochondrial झिल्ली की क्षमता का आकलन करने के लिए.
Abstract
occluded कोरोनरी धमनी के समय पर और कुशल reperfusion एक ST-सेगमेंट ऊंचा रोधगलन के साथ रोगियों में रोधगलन infarct आकार कम करने के लिए सबसे अच्छी रणनीति है । हालांकि, reperfusion प्रति एसई आगे cardiomyocyte मौत, एक reperfusion चोट के रूप में जाना जाता घटना में परिणाम कर सकते हैं । mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना (mPTP), mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी), या mitochondrial ध्रुवीकरण की कमी के साथ खोलने, सार्वभौमिक reperfusion चोट के अंतिम चरण के रूप में पहचाना जाता है और के लिए जिंमेदार है mitochondrial आणि cardiomyocyte मृत्यू. जे. सी.-1 एक lipophilic cationic डाई कि एमएमपी के मूल्य के आधार पर mitochondria में जमा है । जितना अधिक एमएमपी है, उतना ही mitochondria में जे-1 संचित होता है । mitochondria में जे. के.-1 की बढ़ती मात्रा हरे (~ ५३० एनएम) से लाल (~ ५९० एनएम) के लिए एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बदलाव से परिलक्षित किया जा सकता है । इसलिए, लाल/हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात की कमी mitochondria के ध्रुवीकरण का संकेत कर सकते हैं । यहां, हम जे सी-1 का लाभ लेने के लिए एमएमपी उपाय, या हाइपोक्सिया के बाद मानव हृदय myocytes में mPTP के उद्घाटन/
Introduction
कोरोनरी हृदय रोग दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है । कोरोनरी चोट को कम करने और अनुसूचित जनजाति-खंड ऊंचा रोधगलन के साथ रोगियों में infarct आकार सीमित करने के लिए पसंद का उपचार प्राथमिक percutaneous कोरोनरी हस्तक्षेप (पीसीआई)1के माध्यम से समय पर और प्रभावी रोधगलन reperfusion है, 2. हालांकि, reperfusion अतिरिक्त क्षति का कारण बनता है, जो अंतिम infarct आकार3के 30 प्रतिशत तक के लिए खाता कर सकते हैं । यह सार्वभौमिक रूप से स्वीकार किया है कि mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना (mPTP) न केवल mitochondrial क्षति और सेल मौत में ischemia के दौरान केंद्रीय है/reperfusion (I/आर), लेकिन यह भी converging4 संकेत के एक cardioprotective लक्ष्य है , 5. के रूप में mPTP खोलने इनर mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी)4के ध्रुवीकरण के बारे में लाना होगा, हम mPTP का उपयोग कर खोलने का पता लगाया 5, 5 ‘, 6, 6 ‘-Tetrachloro-1, 1 ‘, 3, 3 ‘-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (जे. ए.-1) परख ।
जे. सी.-1 परख एक cytofluorimetric विधि है कि दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक है, और यह एक एकल mitochondria6के स्तर पर एमएमपी का विश्लेषण करके आगे मांय किया गया है । जे. सी.-1 एक एकत्रित रूप के रूप में मौजूद है, सामांय एमएमपी के साथ mitochondria के मैट्रिक्स में नारंगी रंग का उत्सर्जन (५९० ± १७.५ एनएम) के लिए एक लाल उपज; एमएमपी के नुकसान के साथ, जे सी-1 monomeric रूप है कि पैदावार ५३० ± 15 एनएम के उत्सर्जन के साथ हरी प्रतिदीप्ति में बदल जाता है । इसलिए, लाल/हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात में कमी का संकेत मिल सकता है जैसे ischemia/reperfusion (I/आर) के रूप में शर्तों में एमएमपी की कमी ।
जे. पी.-1 के अलावा, एमएमपी भी झिल्ली के साथ अध्ययन किया गया है-पारगंय lipophilic cations जैसे Rhodamine १२३ और 3, 3 ′-dihexyloxadicarbocyanine आयोडाइड [DiOC6 (3)] । हालांकि, इन दो जांचों की तुलना में, जे सी-1 एमएमपी विश्लेषण के लिए अधिक विश्वसनीय है । Rhodamine १२३ अपेक्षाकृत गरीब संवेदनशीलता है (विशेष रूप से शमन मोड7,8में) और गरीब विशिष्टता । rhodamine १२३ में बदलाव कभी इतना छोटा है कि यह शोधकर्ताओं या उपकरणों का निरीक्षण करने के लिए कठिन है/ इसके अलावा, एक ही सेल में, वहां rhodamine १२३ के लिए विभिंन mitochondrion बाध्यकारी साइटों रहे है और इसलिए कि यह अलग प्रतिदीप्ति9उत्सर्जन हो सकता है । DiOC6 (3) एमएमपी का पता लगाने के लिए अनुशंसित नहीं है या तो के रूप में यह प्लाज्मा झिल्ली10के ध्रुवीकरण के लिए संवेदनशील प्रतिक्रिया ।
इसलिए, यहां हम जे सी-1 परख का उपयोग करने के बाद HCMs के एमएमपी का आकलन करने के लिए हाइपोक्सिया/के साथ या एक सुरक्षात्मक एजेंट के बिना ऑक्सीजन उजागर जा रहा है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि जे सी-1 डाई का उपयोग करता है के लिए उजागर किया जा रहा के बाद कोशिकाओं के एमएमपी का आकलन करने के लिए प्रस्तुत एच/जे-1 द्वारा पता लगाया परख, कोशिकाओं के एमएमपी जैसे कारकों से स्वतंत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (no. 2017YFC1700503), चीन के राष्ट्रीय आधारभूत अनुसंधान कार्यक्रम (९७३ प्रोग्राम) (no. 2012CB518602), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (no. ८१३७०२२३) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया । और सं ८१५७३९५७), और पेकिंग यूनियन मेडिकल कॉलेज के स्नातकोत्तरों ‘ अभिनव अनुसंधान फाउंडेशन (2016-1002-01-02) ।
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
